槐耳菌質(zhì)干預(yù)TWIST 介導(dǎo)乳腺癌紫杉醇化療耐藥蛋白及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的機(jī)制研究△

董巖，韓雨杉，高平#

1大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，遼寧 大連 116000

2大連醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院，遼寧 大連 116000

近年來，乳腺癌的發(fā)病率不斷升高，已位居女性惡性腫瘤第1位[1]。隨著手術(shù)、放療、化療等治療手段的應(yīng)用，乳腺癌的病死率明顯降低。相關(guān)研究表明，腫瘤耐藥是導(dǎo)致腫瘤患者化療失敗的最主要原因[2]，因而也是目前腫瘤患者化療過程中急需解決的難題。紫杉醇對乳腺癌等惡性腫瘤具有顯著療效，單藥紫杉醇治療乳腺癌的有效率可達(dá)56%，但卻極易產(chǎn)生耐藥性[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子TWIST及其相關(guān)信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與乳腺癌細(xì)胞的增殖及耐藥具有密切聯(lián)系[4-8]。研究表明，在乳腺癌患者化療過程中給予中醫(yī)治療，可以減輕化療藥物導(dǎo)致的不良反應(yīng)，改善患者的生活質(zhì)量[9]?；倍w粒是國家一類新藥，為槐耳菌質(zhì)的提取物，其原料藥是槐耳清膏，主要活性成分為多糖蛋白[10]。相關(guān)研究表明，槐耳清膏具有抑制乳腺癌細(xì)胞生長、誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子及提高機(jī)體免疫力的作用[11]。本研究對槐耳菌質(zhì)干預(yù)TWIST介導(dǎo)乳腺癌紫杉醇化療耐藥信號(hào)調(diào)控通路的作用機(jī)制進(jìn)行研究，旨在為臨床上應(yīng)用槐耳清膏治療耐藥性乳腺癌提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

乳腺癌MCF-7細(xì)胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 主要試劑與儀器

槐耳清膏購自江蘇啟東蓋天力藥業(yè)有限公司；紫杉醇注射液購自山東齊魯制藥有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Genetech公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；TWIST-shRNA質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒委托上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及構(gòu)建；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；G418購自美國Gibco公司；TWIST、GAPDH基因的上、下游引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR TAQ Real time試劑盒均購自日本Takara公司；全蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；兔抗人磷酸化蛋白激酶B（phosphorylation protein kinase B，p-AKT）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、TWIST、多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance-associated protein，MRP）、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；化學(xué)發(fā)光法試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 耐藥細(xì)胞株的建立

參照低濃度加量持續(xù)誘導(dǎo)法[12]建立穩(wěn)定的耐藥細(xì)胞株：將MCF-7細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中持續(xù)加入紫杉醇，起始濃度設(shè)定為半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）的10%，待存活細(xì)胞開始增殖、細(xì)胞融合度達(dá)80%左右開始傳代，傳至3代后，逐漸增加紫杉醇的濃度，反復(fù)換液、傳代，最終獲得在含2.5 mg/L紫杉醇的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長的耐藥細(xì)胞株，傳5代以上獲得耐藥細(xì)胞株，將其命名為“MCF-7/Taxol”。

1.4 臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)算細(xì)胞存活率[13]

取對數(shù)生長期的MCF-7/Taxol細(xì)胞，將其接種于含10%胎牛血清的RPM1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，胰蛋白酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度，使12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種的細(xì)胞量為1×105個(gè)。培養(yǎng)24 h后，將MCF-7/Taxol細(xì)胞分為4組：對照組，更換含有磷酸鹽緩沖液的培養(yǎng)液培養(yǎng)；紫杉醇組，更換含有終濃度為3 mg/L紫杉醇的培養(yǎng)液培養(yǎng)；槐耳清膏組，更換含有終濃度為2.5 g/L槐耳清膏的培養(yǎng)液培養(yǎng)；合用組，更換含有終濃度為1.5 mg/L紫杉醇和1.0 g/L槐耳清膏的培養(yǎng)液培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。藥物處理24、72、120 h時(shí)，采用0.4%臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)（/活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測細(xì)胞中TWIST、MRP、P-gp蛋白的表達(dá)水平

取藥物處理120 h時(shí)的對照組、紫杉醇組、槐耳清膏組和合用組MCF-7/Taxol細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液，于冰上孵育30 min，刮取細(xì)胞碎片；隨后采用超聲粉碎儀進(jìn)行超聲粉碎，低溫條件下12 000 r/min，離心20 min，收集蛋白樣品。采用BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測蛋白樣品的濃度。配制100 μg蛋白樣品，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟后，加入TWIST、MRP、P-gp抗體（1∶1000稀釋）和內(nèi)參β-actin抗體（1∶10 000稀釋），4℃過夜，然后加入羊抗鼠IgG二抗（1∶1000稀釋），室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像分析儀采集圖像。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6 基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和分組

Lipofectamine 2000介導(dǎo)下進(jìn)行基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡下觀察瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后MCF-7/Taxol細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果；在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入300 μg/ml的G418，以篩選成功轉(zhuǎn)染的MCF-7/Taxol細(xì)胞。經(jīng)過3個(gè)月的篩選實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，將轉(zhuǎn)染帶G418抗性TWIST-shRNA質(zhì)粒的MCF-7/Taxol細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組[即TWIST-shRNA（+）]；將轉(zhuǎn)染帶G418抗性陰性對照質(zhì)粒的MCF-7/Taxol細(xì)胞作為陰性對照組[即TWIST-shRNA（-）]。采用終濃度為3 mg/L的紫杉醇處理TWIST-shRNA（+）組 MCF-7/Taxol細(xì)胞，作為TWIST-shRNA（+）紫杉醇組，將未用紫杉醇處理的TWIST-shRNA（+）組細(xì)胞作為 TWIST-shRNA（+）對照組；采用終濃度為3 mg/L紫杉醇處理TWIST-shRNA（-）組MCF-7/Taxol細(xì)胞，作為TWIST-shRNA（-）紫杉醇組，將未采用紫杉醇處理的TWIST-shRNA（-）組細(xì)胞作為TWIST-shRNA（-）對照組。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.7 RT-PCR 檢測各組細(xì)胞TWISTmRNA表達(dá)水平

待TWIST-shRNA（+）對照組和TWIST-shRNA（-）對照組MCF-7/Taxol細(xì)胞的融合度達(dá)80%時(shí)，采用Trizol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA。采用SYBR Green法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR），TWIST基因的上游引物：5′-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3′；下游引物：5′-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72℃延伸20 s，共35個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，使用2-△△Ct法對TWISTmRNA的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.8 Western blot檢測p-AKT蛋白的表達(dá)水平

取 TWIST-shRNA（+）對照組、TWIST-shRNA（+）紫杉醇組、TWIST-shRNA（-）對照組和TWIST-shRNA（-）紫杉醇組MCF-7/Taxol細(xì)胞，以AKT為內(nèi)參，采用Western blot檢測4組細(xì)胞中p-AKT的表達(dá)水平，具體檢測方法參照“1.5”。p-AKT及AKT抗體的稀釋比例均為1∶1000。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活率的比較

臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測結(jié)果顯示：藥物處理24、72、120 h時(shí)，對照組、紫杉醇組、合用組和槐耳清膏組MCF-7/Taxol細(xì)胞的存活率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意 義（F=5385.418、8798.517、10766.899，P＜0.01）；其中，槐耳清膏組MCF-7/Taxol細(xì)胞的存活率低于對照組、紫杉醇組和合用組，合用組MCF-7/Taxol細(xì)胞的存活率低于對照組和紫杉醇組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但是對照組和紫杉醇組MCF-7/Taxol細(xì)胞的存活率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同組別MCF-7/Taxol細(xì)胞存活率的比較（%，±s）

表1 不同組別MCF-7/Taxol細(xì)胞存活率的比較（%，±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與紫杉醇組比較，P＜0.05；c與合用組比較，P＜0.05

組別對照組紫杉醇組合用組槐耳清膏組24 h 98.48±0.73 97.86±0.82 84.82±0.74a b 60.25±0.62a b c 72 h 98.31±0.92 97.68±0.75 75.92±0.70a b 51.84±0.29a b c 120 h 98.18±0.85 98.00±0.91 61.03±0.96a b 38.71±0.63a b c

2.2 TWIST、MRP、P-gp 蛋白表達(dá)水平的比較

Western Blot檢測結(jié)果顯示，藥物處理120 h時(shí)，對照組、紫杉醇組、合用組和槐耳清膏組MCF-7/Taxol細(xì)胞中TWIST、MRP、P-gp蛋白的相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=221.487、405.282、190.485，P＜0.01）。其中，紫杉醇組MCF-7/Taxol細(xì)胞中TWIST、MRP、P-gp蛋白的相對表達(dá)量均高于對照組，槐耳清膏組MCF-7/Taxol細(xì)胞中TWIST、MRP、P-gp蛋白的相對表達(dá)量均低于紫杉醇組和合用組，槐耳清膏組MCF-7/Taxol細(xì)胞中TWIST、P-gp蛋白的相對表達(dá)量均低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同組別MCF-7/Taxol細(xì)胞中TWIST、MRP、P-gp蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

表2 不同組別MCF-7/Taxol細(xì)胞中TWIST、MRP、P-gp蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與紫杉醇組比較，P＜0.05；c與合用組比較，P＜0.05

組別對照組紫杉醇組合用組槐耳清膏組TWIST 1.00±0.08 2.56±0.21a 1.62±0.18a b 0.79±0.14a b c MRP 1.00±0.10 5.48±0.35a 3.01±0.42a b 1.16±0.28b c P-gp 1.00±0.12 1.70±0.26a 0.82±0.09a b 0.64±0.11a b c

2.3 TWISTmRNA和p-AKT 蛋白表達(dá)水平的比較

RT-PCR法檢測結(jié)果顯示，TWIST-shRNA（+）對照組MCF-7/Taxol細(xì)胞中TWISTmRNA的相對表達(dá)量為（1.00±0.25），明顯低于TWIST-shRNA（-）對照組的（25.13±5.60），表明TWIST-shRNA轉(zhuǎn)染成功。Western blot檢測結(jié)果顯示，TWIST-shRNA（-）紫杉醇組MCF-7/Taxol細(xì)胞中p-AKT的相對表達(dá)量為TWIST-shRNA（-）對照組的（3.29±0.15）倍，TWIST-shRNA（+）紫杉醇組MCF-7/Taxol細(xì)胞中p-AKT的相對表達(dá)量為TWIST-shRNA（+）對照組的（0.85±0.21）倍（圖1）。

圖1 Western blot 檢測不同組別MCF-7/Taxol細(xì)胞中p-AKT 蛋白的表達(dá)水平

3 討論

近年來，乳腺癌的發(fā)病率逐年增高，已成為腫瘤致女性死亡的重要原因，研究表明，全世界每年約有12%的新發(fā)乳腺癌病例，而其中10%的乳腺癌死亡病例發(fā)生在中國[1,14]。目前，化療是臨床治療乳腺癌的主要手段之一，通過靜脈應(yīng)用化療藥物，可以促進(jìn)腫瘤病灶萎縮，提高乳腺癌患者的生存率和生活質(zhì)量。相關(guān)研究表明，分子生物學(xué)相關(guān)因子的改變，如耐藥相關(guān)蛋白的高表達(dá)，是導(dǎo)致化療失敗的常見原因[15]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子TWIST在腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用[16]。TWIST是一種堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，其不僅可以激活或增強(qiáng)肺耐藥蛋白、MRP、P-gp、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱa等的表達(dá)，還可以激活A(yù)KT等介導(dǎo)的與腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)通路，從而形成以TWIST轉(zhuǎn)錄因子為中心的介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖及耐藥的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[17-18]。

磷酯酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）家族成員屬于原癌基因，PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是PI3K家族介導(dǎo)的眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，對調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡尤為重要[19]。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K下游的作用靶點(diǎn)。PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的抗凋亡信號(hào)途徑，在細(xì)胞的存活、增殖、細(xì)胞骨架變化及凋亡等過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不僅在惡性腫瘤中異常激活，并且與多種一線化療藥物的耐藥性關(guān)系密切[20-23]。相關(guān)研究表明，在宮頸癌細(xì)胞中，TWIST可以通過調(diào)控AKT信號(hào)通路使宮頸癌細(xì)胞對紫杉醇產(chǎn)生耐藥性[24]。本研究結(jié)果顯示，槐耳清膏組MCF-7/Taxol細(xì)胞的存活率低于對照組、紫杉醇組和合用組（P＜0.05），表明槐耳菌質(zhì)對紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞具有良好的殺傷作用。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，藥物處理120 h時(shí)，紫杉醇組MCF-7/Taxol細(xì)胞中TWIST、MRP、P-gp蛋白的相對表達(dá)量均高于對照組，槐耳清膏組MCF-7/Taxol細(xì)胞中TWIST、MRP、P-gp蛋白的相對表達(dá)量均低于紫杉醇組和合用組，槐耳清膏組MCF-7/Taxol細(xì)胞中TWIST、P-gp蛋白的相對表達(dá)量均低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；提示乳腺癌細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性可能與TWIST、MRP、P-gp蛋白有關(guān)，而槐耳菌質(zhì)能夠通過抑制上述蛋白的表達(dá)逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的紫杉醇耐藥。本研究進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TWIST-shRNA（-）紫杉醇組MCF-7/Taxol細(xì)胞中p-AKT的相對表達(dá)量為TWIST-shRNA（-）對照組的（3.29±0.15）倍，而TWIST-shRNA（+）紫杉醇組MCF-7/Taxol細(xì)胞中p-AKT的相對表達(dá)量為TWIST-shRNA（+）對照組的（0.85±0.21）倍，表明TWIST基因沉默后，紫杉醇對乳腺癌細(xì)胞中p-AKT蛋白表達(dá)水平的影響變小，TWIST可能通過調(diào)控AKT信號(hào)通路使乳腺癌細(xì)胞對紫杉醇產(chǎn)生耐藥性。

綜上所述，槐耳菌質(zhì)能夠有效地抑制紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞的增殖，并通過下調(diào)TWIST、MRP、P-gp蛋白的表達(dá)逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的紫杉醇耐藥性；而乳腺癌細(xì)胞紫杉醇耐藥性的產(chǎn)生與TWIST介導(dǎo)的AKT信號(hào)通路密切相關(guān)。該發(fā)現(xiàn)為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了新思路，為降低腫瘤耐藥率、提高腫瘤治療有效率提供了理論基礎(chǔ)。