高遷移率族蛋白A2與原發(fā)性肝細胞癌患者臨床病理特征及其預(yù)后的關(guān)系

楊晉，夏先明，賀凱，張孟瑜，馮春紅，秦蜀

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，四川 瀘州 646000）

原發(fā)性肝癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。我國由于乙肝人數(shù)多，患者治療依從性差，全球每年約一半的新發(fā)肝癌病例發(fā)生在我國[1]。但目前關(guān)于肝癌發(fā)生、發(fā)展的機制尚不明確，因此，闡明肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的分子生物學(xué)機制或?qū)⒂兄诟伟┗颊叩脑缙谠\斷和治療[2]。高遷移率族蛋白A2（high mobilitygroup protein A2,HMGA2）屬于非組蛋白染色體蛋白，無轉(zhuǎn)錄活性[3]。其對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用主要通過與染色質(zhì)結(jié)合或直接與蛋白發(fā)生作用而實現(xiàn)[4]。 HMGA2 一般只在胎發(fā)育早期高表達，在正常成體組織中HMGA2 的表達水平極低或幾乎檢測不到[5]。 而在多種實體惡性腫瘤，例如胃癌、食管癌及結(jié)腸癌中HMGA2 呈高表達，這提示HMGA2 可能在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[6]。目前關(guān)于HMGA2 與肝細胞癌關(guān)系的研究報道較少，因此本研究探討HMGA2 表達與原發(fā)性肝細胞癌患者臨床病理特征及其預(yù)后的關(guān)系，旨在為進一步闡明HMGA2 在肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供 依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月—2013年1月在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科行手術(shù)切除的肝細胞癌患者 120例。其中，男性79例，女性41例；年齡32 ～83歲，中位年齡54 歲。臨床分期以中晚期為主，Ⅰ、Ⅱ期55例，Ⅲ、Ⅳ期65例。納入標準：①病理類型為肝細胞癌，且為首次確診。②患者行手術(shù)治療，手術(shù)切除標本保存于本院病理科，且標本符合本研究實驗設(shè)計要求，即包括癌組織、癌旁組織及正常組織。排除標準：①圍手術(shù)期非腫瘤性病因死亡。②同時合并有其他惡性腫瘤或有惡性腫瘤病史。③臨床資料或隨訪信息不全。

1.2 試劑

鼠抗人HM GA2 單克隆抗體（美國Abcam 公司），免疫組織化學(xué)SP 試劑盒購（美國Zymed 公司）。一抗工作濃度為1 ∶100。二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine,DAB）顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限 公司）。

1.3 方法

采用免疫組織化學(xué)染色，組織均經(jīng)甲醛固定后，石蠟包埋，厚切片，厚度約4μm。對切片組織進行常規(guī)脫蠟、水化，過氧化氫去離子水孵育，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的干擾。乙二胺四乙酸液高溫修復(fù)抗原，自然冷卻后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）沖洗，滴加100μl 鼠抗人HMGA2（濃度1 ∶100），4℃冰箱孵育過夜。PBS 沖洗3 次，2 min/次。滴加二抗，37℃環(huán)境下孵育20 ～30 min。PBS 沖洗 3 次，2 min/次。DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS 代替一抗作為陰性對照。采用半定量積分法判斷陽性結(jié)果，以出現(xiàn)棕色顆粒作為HMGA2 陽性標準。染色強度評分：無染色0 分，淺黃色1 分，棕黃色2 分，棕褐色3 分；高倍鏡（400 倍）下每張切片隨機取10 個視野，每個視野計數(shù)100 個細胞，計算陽性細胞占同類細胞的百分數(shù)：細胞陽性率分為0 ～＜25%、25%～＜50%、50%～75%及＞ 75%，分別計為0、1、2、3 和4 分。兩者乘積結(jié)果是0 分為陰性（-），1 ～4 分為弱陽性（+），5 ～8 分為陽性（++），9 ～12 分為強陽性（+++），將弱陽性和陽性定義為低表達，強陽性定義為高表達，將患者分為HMGA2 陽性組和HMGA2 陰性組，分別為59 和 61例。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，進一步的兩兩比較采用χ2分割法；繪制生存曲線，比較采用Log rank χ2檢驗；影響因素的分析采用Logistic 回歸模型，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色

HMGA2 陽性表達呈棕黃色或棕褐色細顆粒狀，主要定位于腫瘤細胞的細胞核。在120例患者中，HMGA2 在癌組織中的陽性率為35.8% （43/120），在癌旁組織中的陽性率為15.8%（19/120），在正常肝組織中的陽性率為8.3%（10/120），經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.558，P= 0.000）。癌組織比正常肝組織和癌旁組織高。見 圖1。

2.2 不同影響因素下肝細胞癌組織HMGA2 陽性表達率比較

圖1 HMGA2 在肝細胞癌組織中的表達 （免疫組織化學(xué)×400）

不同臨床分期、肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移肝細胞癌患者的HMGA2 陽性表達率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。HMGA2 陽性表達率在高臨床分期、有肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移肝細胞癌患者中較高。不同性別、年齡、腫瘤直徑肝細胞癌患者的HMGA2 陽性表達率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 肝細胞癌組織HMGA2 陽性表達的多因素Logistic 分析

將臨床分期、肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移納入Logistic 回歸模型進行多因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)臨床分期、肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移均是影響HMGA2 陽性表達的獨立危險因素（P＜0.05）。見表2。

2.4 兩組患者3年生存率比較

HMGA2 陽性組患者3年死亡45例，生存率為23.7%，HMGA2 陰性組患者3年死亡33例，生存率為45.9%，經(jīng)Log rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.481，P=0.011）。見圖2。

表1 不同影響因素下肝癌組織HMGA2 蛋白陽性表達率比較

表2 肝細胞癌組織HMGA2 陽性表達的多因素Logistic 回歸分析相關(guān)參數(shù)

圖2 兩組患者3年生存率比較

3 討論

與其他惡性腫瘤一樣，原發(fā)性肝細胞癌確切的病因及分子機制尚不完全清楚。其發(fā)病是一個階段多、步驟多的復(fù)雜過程，受基因與環(huán)境雙重因素影響，臨床上以有肝區(qū)疼痛、腹脹及上腹部包塊等癥狀為主[7]。 HMG 是由HMGA基因編碼的一類非組蛋白家族，正常情況下，在高度分化或成熟細胞及組織中表達量極低，但在多種惡性腫瘤中，表達量則顯著提高。 閆艷琴等[8]對60例食管鱗癌患者的病理標本進行檢測后發(fā)現(xiàn)，HMGA2 在食管鱗癌組織及正常組織中的陽性率分別為71.0%和4.8%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。HELMKE 等[9]研究結(jié)果表明，HMGA2 在結(jié)腸癌中的陽性率為50%，在正常組織中幾乎檢測不到。而關(guān)于HMGA2 與肝細胞癌關(guān)系的研究則相對較少。劉蓓等[10]運用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）對103例肝癌患者的手術(shù)標本檢測后發(fā)現(xiàn)，HMGA2 mRNA 在肝癌組織中的陽性表達率為43.69%，顯著高于正常肝組織。本研究也發(fā)現(xiàn)，HMGA2 主要定位于腫瘤細胞的細胞核。與癌組織相比，正常肝組織和癌旁組織HMGA2 陽性率均較低。本研究中HMGA2 陽性表達率較文獻報道[8-10]稍低，可能與本研究中患者的納入標準、排除標準更為嚴格及本研究采用的免疫組織化學(xué)法敏感性稍低于RT-PCR 有關(guān)。

在免疫組織化學(xué)法基礎(chǔ)上，進一步分析HMGA2表達與肝細胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系。HMGA2表達在高臨床分期、有肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移肝細胞癌患者中表達較高。進一步應(yīng)用Logistic 回歸模型進行多因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)臨床分期、肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移均是影響HMGA2 表達的獨立危險因素，這表明HMGA2 表達對肝細胞癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移均有重要影響，這與劉穎等[11]和呂柏楠 等[3]的研究結(jié)果基本一致。筆者推測可能的原因為：①上皮鈣黏蛋白基因的轉(zhuǎn)錄受生長因子β 信號通路中的SNAIL、TWIST等基因調(diào)控，HMGA2 可通過上調(diào)相關(guān)基因的表達抑制上皮鈣黏蛋白基因轉(zhuǎn)錄，促進細胞間極性消失而誘發(fā)上皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition,EMT），而EMT 正是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程[12-13]。②HMGA2 表達與腫瘤血管生成密切相關(guān)。LI 等[13]報道稱HMGA2基因表達與血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移存在明顯的相關(guān)關(guān)系，高HMGA2 表達的腫瘤組織微血管更為豐富。上述因素共同作用，相互促進，使得HMGA2 陽性的肝癌細胞更易擴散，形成肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移灶。

本研究提示臨床分期、肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移與HMGA2 陽性表達密切相關(guān)，這表明HMGA2 陽性患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的可能性更高，臨床分期更晚，預(yù)后明顯較差。因此，HMGA2 可作為判斷肝細胞癌患者預(yù)后的一個潛在指標。

綜上所述，HMGA2 定位于腫瘤細胞的細胞核，主要表達于癌組織，但在癌旁組織、正常肝組織中也有一定陽性率。臨床分期、肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移與HMGA2 表達密切相關(guān)。HMGA2 陽性患者預(yù)后明顯較差，HMGA2 可作為判斷肝細胞癌患者預(yù)后的一個潛在指標。