體外受精周期低受精與精子相關(guān)參數(shù)的多因素分析*

邢鵬，陳英，于曉光，殷晨星，李克用，袁博

（1.保定市婦幼保健院 生殖醫(yī)學(xué)科，河北 保定 071000；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院兒科， 河北 保定 071000）

在體外受精（in vitro fertilization,IVF）過程中完全不受精或低受精（＜30%）的發(fā)生率為4%～16%[1]。受精過程包括：精卵識(shí)別、精子發(fā)生頂體反應(yīng)（acrosome reacted,AR）、精卵質(zhì)膜融合、卵子皮質(zhì)反應(yīng)阻止多精受精及雌雄原核形成與融合，任何環(huán)節(jié)的異常都可能導(dǎo)致受精失敗[2]。常見影響因素包括：不孕類型、不孕年限及女方卵巢功能和促排卵方案等[3-4]。而精液參數(shù)的影響一直存在爭議，不同的研究往往得出有差異的結(jié)論，這種差異性可能是由于女方因素的偏倚導(dǎo)致[5-7]。本研究通過匹配女方因素控制偏倚，以分析低受精的發(fā)生與精子因素的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月—2018年10月于保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科進(jìn)行IVF 助孕的患者264例。 納入標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)不孕；②女方年齡＜40 歲，BMI 18 ～25， 基 礎(chǔ) 促 卵 泡 激 素（follicle-stimulating hormone,FSH）≤12 IU/L，基礎(chǔ)竇卵泡素≥7 枚，獲卵數(shù)≥5 枚[8]；③月經(jīng)期或黃體期長方案促排卵。排除標(biāo)準(zhǔn)：①女方患有多囊卵巢綜合征和子宮內(nèi)膜異位癥；②女方既往有卵巢腫瘤病史；③男方前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)＜5×106個(gè)，正常形態(tài)精子率＜4%，特別是圓頭精子癥等；④雙方任何一方染色體異常。根據(jù)受精5 ～6 h 拆卵后第二極體的出現(xiàn)與否，將患者分為低受精組（受精率＜30%）和正常受精組（受精 率≥30%），分別有63 和201例。

1.2 方法

1.2.1 IVF 治療 患者均采用月經(jīng)期或黃體期GnRHa法長方案。取卵日男方精液經(jīng)Sperm Grad 密度梯度離心法優(yōu)選，與卵子在二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中受精。

1.2.2 受精判斷 受精5 ～6 h 后早剝卵，通過觀察第二極體的排出情況確定受精與否。對(duì)于未排出第二極體的卵細(xì)胞，最遲觀察到受精7 h 后，對(duì)未受精的卵細(xì)胞行早補(bǔ)救卵質(zhì)內(nèi)單精子注射。

1.2.3 精子分析 根據(jù)《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊（第5 版）》[9]進(jìn)行各項(xiàng)精子參數(shù)的檢測。分別記錄正常形態(tài)精子率、頭部缺陷精子率、中段缺陷精子率、尾部缺陷精子率、過量胞漿殘留率，并計(jì)算精子畸形指數(shù)，精子畸形指數(shù)=計(jì)數(shù)精子缺陷總數(shù)/計(jì)數(shù)精子總數(shù)。記錄混合抗球蛋白反應(yīng)（mixed antiglobulin reaction,MAR）、自發(fā)AR、精子DNA 碎片指數(shù)、精子前向運(yùn)動(dòng)比率、前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)、洗滌后精子前向運(yùn)動(dòng)比率及洗滌后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)。

1.3 主要試劑

Diff-Quik 快速染色試劑盒、抗精子抗體檢測試劑盒（混合抗球蛋白凝集法）、精子頂體染色試劑盒（PSA-FITC 染色法）及精子DNA 碎片染色試劑盒（瑞-吉染色法）均購自安徽安科生物工程（集團(tuán)）股份有限公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 和Medclac 17.2 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；影響因素分析采用二分類Logistic 回歸模型，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic curve,ROC），并計(jì)算曲線下面積（area under curve,AUC），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基本資料比較

兩組患者男女性年齡、不孕年限、女性BMI、基礎(chǔ)FSH 和獲卵數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明兩組患者的基線數(shù)據(jù)整齊，較好地平衡了女方因素對(duì)受精率影響的偏倚。見表1。

2.2 兩組患者精子參數(shù)比較

兩組患者頭部缺陷精子率、精子畸形指數(shù)和自發(fā)AR 比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），低受精組高于正常受精組。調(diào)整了入組標(biāo)準(zhǔn)后，前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)、MAR 及精子DNA 碎片指數(shù)等指標(biāo)，對(duì)IVF 周期低受精未表現(xiàn)出預(yù)測價(jià)值。見 表2。

2.3 IVF 低受精的Logistic 回歸分析

將差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)自發(fā)AR、頭部缺陷精子率和精子畸形指數(shù)作為自變量，將IVF 周期低受精是否發(fā)生作為因變量，采用二分類Logistic 回歸分析，建立預(yù)測低受精發(fā)生的回歸方程：Logit（P）= -19.234+0.124 頭部缺陷精子率+3.212 精子畸形指數(shù)+ 0.237 自發(fā)AR。結(jié)果顯示，頭部缺陷精子率、精子畸形指數(shù)和自發(fā)AR 均為IVF 周期低受精的影響因素（P＜0.05）。見表3。

2.4 不同精子參數(shù)及回歸方程預(yù)測IVF 周期低受精的ROC 曲線分析

根據(jù)AUC 比較3 項(xiàng)精子參數(shù)及回歸方程的預(yù)測價(jià)值，根據(jù)約登指數(shù)確定截?cái)嘀导懊舾行院吞禺愋浴Ｍㄟ^各因素AUC 比較可知，回歸方程的預(yù)測價(jià)值最大。見表4和圖1。

表1 兩組患者基本資料比較 （±s）

表1 兩組患者基本資料比較 （±s）

組別 n 女性年齡/歲 男性年齡/歲 不孕年限 女性BMI/（kg/m2） 基礎(chǔ)FSH/（IU/L） 獲卵數(shù)/枚低受精組 63 29.09±4.74 29.71±4.25 3.53±1.69 21.93±1.92 7.69±2.58 8.62±3.93正常受精組 201 28.84±4.51 29.45±5.27 3.16±1.44 22.32±2.07 7.27±2.62 9.28±3.46 t 值 0.379 0.409 1.722 1.355 1.099 1.204 P 值 0.705 0.683 0.086 0.177 0.273 0.232

表2 兩組患者精子參數(shù)比較 （±s）

表2 兩組患者精子參數(shù)比較 （±s）

組別 n 正常形態(tài)精子率/%頭部缺陷精子率/%中段缺陷精子率/%尾部缺陷精子率/%過量胞漿殘留率/% 精子畸形指數(shù) MAR/%低受精組 63 4.60±1.85 88.37±5.22 25.18±5.26 10.68±3.10 5.08±2.40 1.43±0.17 10.73±5.13正常受精組 201 4.90±1.75 83.45±7.16 24.57±6.88 10.42±3.34 5.70±2.62 1.34±0.15 9.74±4.84 t 值 1.173 5.928 0.746 0.551 1.673 3.905 1.397 P 值 0.242 0.000 0.457 0.582 0.095 0.000 0.164洗滌后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)/（×106 個(gè)/L）低受精組 63 13.05±8.62 15.17±5.35 24.97±9.45 23.00±8.10 84.86±7.22 17.56±6.14正常受精組 201 11.06±7.69 10.22±3.85 22.94±7.88 21.21±7.15 85.83±6.34 19.02±7.39 t 值 1.743 6.812 1.701 1.680 1.031 1.573 P 值 0.082 0.000 0.090 0.094 0.303 0.118組別 n 精子DNA 碎片指數(shù)/% 自發(fā)AR/% 精子前向運(yùn)動(dòng) 比率/%前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)/（×106 個(gè)/L）洗滌后精子前向 運(yùn)動(dòng)比率/%

表3 IVF 周期低受精的Logistic 回歸分析參數(shù)

表4 預(yù)測IVF 周期低受精的相關(guān)參數(shù)

圖1 不同參數(shù)及回歸方程預(yù)測IVF 周期低受精的 ROC 曲線

3 討論

短時(shí)受精結(jié)合早補(bǔ)救卵質(zhì)內(nèi)單精子注射增加了胚胎利用率，改善了低受精或完全不受精患者的臨床結(jié)局[1，10-11]。但是，并不是所有卵子均在受精后6 h 左右排出第二極體，10%左右的卵子會(huì)在更晚的時(shí)間排出，過早的補(bǔ)救可能導(dǎo)致人類常規(guī)體外受精中3 原核受精卵的發(fā)生[12]。早期剝除卵丘顆粒細(xì)胞，阻斷了顆粒細(xì)胞與卵細(xì)胞之間的相互作用[13]。此外，如果對(duì)患者均行早期剝卵觀察，不僅增加胚胎暴露時(shí)間，而且增加了胚胎實(shí)驗(yàn)室人員的工作量。因此，研究低受精發(fā)生的相關(guān)因素，進(jìn)行科學(xué)的預(yù)測具有重要意義。

有研究指出正常形態(tài)精子率≥4%為選擇IVF 助孕的指征，而其＜4%則應(yīng)選擇卵質(zhì)內(nèi)單精子注射助 孕[14-15]。與其他精子形態(tài)學(xué)異常相比，頭部缺陷精子率與低受精的發(fā)生顯示出更強(qiáng)的相關(guān)性。GATIMEL等[16]將不同的精子形態(tài)與病理生理學(xué)聯(lián)系起來，發(fā)現(xiàn)頭部缺陷，特別是全部球形精子癥、巨頭畸形及斬首精子綜合征等存在嚴(yán)重的生理和遺傳學(xué)缺陷。AUGER 等[17]同樣發(fā)現(xiàn)在不育人群中上述頭部缺陷的精子比例較可育組明顯升高。

1996年AZIZ 等[18]首次報(bào)道SDI 可作為IVF 結(jié)果的預(yù)測指標(biāo)。精子畸形指數(shù)納入了多重精子缺陷指數(shù)，較之單一的缺陷率，具有更佳的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，世界衛(wèi)生組織第5 版手冊也將其納入為可供選擇的評(píng)估指標(biāo)[9]。江偉杰等[19]關(guān)于受精失敗的預(yù)測模型中，將SDI 納入了Logistic 變量，與本研究的結(jié)論類似。

精子-卵子相互識(shí)別、結(jié)合并最終相互融合是有性生殖的顯著特點(diǎn)，而透明帶誘導(dǎo)的AR 缺陷是IVF中受精失敗的重要原因[20]。AR 缺陷主要表現(xiàn)為大量自發(fā)AR，其原因?yàn)轫旙w的過早成熟，并與受精失敗顯著相關(guān)[21]。XU 等[22]通過前瞻性隊(duì)列研究，最終發(fā)現(xiàn)自發(fā)AR 是受精結(jié)果的唯一重要預(yù)測因子。

綜上所述，頭部缺陷精子率、精子畸形指數(shù)及自發(fā)AR 與IVF 低受精的發(fā)生相關(guān)，預(yù)測低受精發(fā)生的Logistic 回歸方程具有較好的預(yù)測價(jià)值。當(dāng)回歸方程預(yù)測值（P）＞-1.461 時(shí)，建議患者選擇卵質(zhì)內(nèi)單精子注射助孕。