白細胞介素-17對脫氧皮質(zhì)酮/鹽誘導的高血壓心肌纖維化大鼠巨噬細胞極化的影響*

周俊嶺，范彬，馬禮坤

（1.中國科學技術(shù)大學附屬第一醫(yī)院 心血管內(nèi)科，安徽 合肥 230031；2.安徽醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，安徽 合肥 230041）

心肌纖維化（myocardial fibrosis,MF）是心肌組織中類成纖維細胞過度增殖，大量合成細胞外基質(zhì)的病理過程[1-2]。既往在脫氧皮質(zhì)酮（Deoxycorticosterone,DOC）/鹽誘導的大鼠MF 中觀察到顯著的炎癥反應[2-3]。巨噬細胞是炎癥反應的主要載體，有研究顯示MF 心肌組織中巨噬細胞浸潤明顯，但其如何聚集激活和極化較少報道[3-4]。當前探討白細胞介素-17（Interleukin-17,IL-17）對免疫炎癥反應的調(diào)控作用已成為研究的熱點之一[5]。有研究表明IL-17 在MF中發(fā)揮重要作用，但是否對巨噬細胞有調(diào)控作用鮮有報道[6-7]。本研究通過復制DOC/鹽誘導的高血壓MF大鼠模型，觀察IL-17 對巨噬細胞極化狀態(tài)和心肌組織炎癥反應的影響，探討IL-17 對巨噬細胞的極化作用。

1 材料與方法

1.1 動物

30 只雄性SD 大鼠（體重180 ～240 g）由安徽醫(yī)科大學動物實驗中心提供，清潔級環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

DOC 購自美國Sigma 公司，注射用大豆油購自浙江田雨山大豆油開發(fā)有限公司，免疫組織化學SP 試劑盒、DAB 顯色劑及免疫印跡BCA 定量試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，CD206、CD11c、誘導性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）、精氨酸酶1（Arginase 1,Arg1）及內(nèi)參照（β-actin）一抗購自美國Millipore 公司，iNOS、Arg1 引物由上海生工生物工程有限公司合成（見表1）[8]，mRNA 提取試劑盒購自德國Qiagen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及染料法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）試劑盒購自日本TaKaRa 公司，ABI Step One Plus System RT-PCR 儀由安徽醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院寄生蟲學教研室提供。

表1 iNOS 和Arg1 的引物序列

1.3 高血壓MF 大鼠的模型復制

采用10%水合氯醛（400 mg/kg）對大鼠進行腹腔麻醉后實施右腎切除術(shù)，術(shù)后用含0.1%氯化鉀和1%氯化鈉的飲水灌胃2 周，隨機分成對照組、DOC組及DOC+IL-17 抗體組，每組10 只。對照組：大豆油皮下注射，1 次/4 d，生理鹽水腹腔注射，1 次/周；DOC 組：皮下注射DOC 60 mg/kg，1 次/4 d，生理鹽水腹腔注射，1 次/周；DOC+IL-17 抗體組：皮下注射DOC 60 mg/kg，1 次/4 d，同時給予IL-17 特異性抗體（150μg/鼠）腹腔注射，1 次/周。對照組和DOC 組腹腔注射鹽水與IL-17 特異性抗體體積相同；各組皮下注射大豆油體積一致。動物模型復制周期為14 d。實驗開始前和實驗第14 天分別采用尾套法測量各組大鼠收縮壓。動物模型復制周期結(jié)束后，予10%水合氯醛400 mg/kg 腹腔麻醉后處死各組大鼠，摘取心臟，切下心室。將心室分成3 份，1 份放入4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片后做HE 染色、苦味酸-天狼猩紅膠原染色和免疫組織化學染色。另2 份（心尖部）放入-80℃冰箱凍存，備用于RT-PCR和Westren blotting。

1.4 MF 檢測

按照苦味酸-天狼猩紅膠原染色法流程對石蠟切片逐步染色，烤片、封片后使用尼康顯微鏡照相系統(tǒng)拍照，各組隨機選取圖像。以心肌間質(zhì)膠原面積/視野總面積比值表示心肌間質(zhì)纖維化程度，采用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測量。

1.5 心肌組織炎癥病理改變

取出部分左心室心肌組織后，直接浸于4%多聚甲醛中固定24 h 充分水洗，脫水，石蠟包埋后將大鼠左室心肌組織切成4μm 厚的薄片，置于防脫載玻片上烤片備用。石蠟切片進行HE 染色，觀察心肌組織炎癥反應情況。

1.6 免疫組織化學法檢測M1 型、M2 型巨噬細胞的表達

石蠟切片采用檸檬酸鹽修復液95℃修復10 min，3%雙氧化氫37℃封閉8 min，10%山羊血清37℃封閉30 min，分別滴加CD11c（1 ∶400）、CD206（1 ∶400）一抗4℃孵育過夜，先后滴加生物素化二抗工作液和辣根標記鏈酶卵白素工作液37℃孵育25 min，然后二氨基聯(lián)苯胺顯色。各步驟間用磷酸鹽緩沖液充分洗滌5 次，4 min/次，蘇木精復染6 min，脫水、透明并封片。磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。使用尼康顯微鏡照相系統(tǒng)隨機選取陽性表達區(qū)內(nèi)10 個視野，在200倍視野下拍攝圖像。利用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件計算CD11c、CD206 的積分光密度值（integral optical density,IOD），每張切片取平均值。

1.7 RT-PCR 檢測iNOS 和Arg1 mRNA 的表達

取適量的左心室心肌組織研磨成勻漿液，按照Qiagen RNA 提取試劑盒說明書步驟提取總RNA，紫外分光光度計檢測所提取總RNA 的純度及濃度。取5μl RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)RT-PCR 試劑盒和RT-PCR 儀推薦的反應體系進行實時定量擴增。反應體系為20μl，反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40 個循環(huán)。采用RT-PCR儀對各個樣品得到的反應結(jié)果進行分析并得出Ct 值，采用2-ΔΔCt法對iNOS 和Arg1 mRNA 表達水平進行相對定量。

1.8 Western blotting 檢測IL-17、iNOS 和Arg1蛋白的表達

用RIPA 組織裂解液提取左心室心肌組織總蛋白，BCA 法測定總蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，加熱變性后電泳，印跡轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜，漂洗、封閉后，將PVDF 膜放入一抗稀釋液中4℃緩慢搖晃孵育過夜。將PVDF 膜放入相應的二抗稀釋液中，室溫反應2 h，采用辣根過氧化物酶HRP-ECL 底物發(fā)光試劑對蛋白進行顯色，每步驟間充分漂洗，在暗室中曝光后完全定影，通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析定影后的條帶光密度（optical density,OD）。利用Image Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)計算每個蛋白條帶OD 值。同樣的方法檢測內(nèi)參照β-actin 蛋白，樣本目的蛋白相對含量=目的蛋白條帶OD 值/β-actin 條帶OD 值。

1.9 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析或重復測量設(shè)計的方差分析，進一步的兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠收縮壓比較

SD 大鼠右腎切除術(shù)后，對照組、DOC 組及DOC+IL-17 組第0 天的收縮壓分別為（134±12）、（139±11）和（130±11）mmHg，第14 天 分 別 為（132±5）、（164±5）和（160±10）mmHg，采用重復測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的收縮壓比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=59.063，P=0.000）；②各組收縮壓比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=17.566，P=0.000），DOC 組與DOC+IL-17 組收縮壓比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；③各組收縮壓的變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=18.323，P=0.000）。

2.2 各組大鼠MF 程度

大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維呈紅色，其余心肌組織呈黃色。苦味酸-天狼猩紅膠原染色法結(jié)果顯示：對照組心肌間質(zhì)膠原面積/視野總面積比值為（3.136±1.389）%、DOC 組 為（32.139±25.300）%、DOC+IL-17 抗體組為（4.540±1.150）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=247.647，P=0.000）。進一步兩兩比較，經(jīng)LSD-t檢驗，DOC 組較對照組增加（P＜0.05）；使用IL-17 抗體中和干預治療后，DOC+IL-17 抗體組心肌間質(zhì)膠原面積/視野總面積比值較DOC 組減少（P＜0.05）。見圖1、2。

2.3 各組大鼠心肌組織炎癥反應

圖1 各組大鼠MF 程度

圖2 各組大鼠MF 程度比較 （n=10，±s）

對照組大鼠左心室心肌細胞排列有序，而DOC組心肌細胞排列紊亂，大量炎癥細胞浸潤并伴有纖維化瘢痕組織形成；經(jīng)IL-17 抗體中和干預后，DOC+IL-17 抗體組心肌細胞排列基本有序，有少量炎癥細胞浸潤。見圖3。

2.4 各組大鼠巨噬細胞浸潤情況

以CD11c 陽性表達細胞代表M1 型巨噬細胞浸潤情況，以CD206 陽性表達細胞代表M2 型巨噬細胞浸潤情況，結(jié)果：①各組CD11c 的IOD 值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，DOC 組CD11c 的IOD 值較對照組增加（P＜0.05）；使用IL-17 抗體中和干預治療后，DOC+IL-17 抗體組CD11c 的IOD 值較DOC 組減少（P＜0.05）。②各組CD206 的IOD 值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，DOC 組CD206 的IOD 值較對照組增加（P＜0.05）；使用IL-17 抗體中和干預治療后，DOC+IL-17 抗體組CD206 的IOD 值較DOC 組減少（P＜0.05）。見圖4～6 和表2。

圖3 各組大鼠心肌組織病理切片 （HE 染色×200）

圖4 各組大鼠心肌組織CD11c 陽性表達 （免疫組織化學×200）

圖5 各組大鼠心肌細胞CD206 陽性表達 （免疫組織化學×200）

圖6 各組大鼠CD11c、CD206 IOD 值比較 （n=10，±s）

表2 各組大鼠CD11c、CD206 的IOD 值比較 （n=10，±s）

表2 各組大鼠CD11c、CD206 的IOD 值比較 （n=10，±s）

組別 CD11c CD206對照組 2 812.173±459.245 1 059.458±305.194 DOC 組 13 876.401±2 046.109 6 586.125±647.570 DOC+IL-17 組 5 963.516±847.240 2 754.287±421.503 F 值 194.514 345.888 P 值 0.000 0.000

2.5 各組大鼠iNOS 和Arg1 mRNA 相對表達量比較

M1 型巨噬細胞分泌iNOS，M2 型巨噬細胞主要分泌Arg1。各組iNOS 和Arg1 mRNA 相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步的兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，DOC 組iNOS 和Arg1 mRNA 相對表達量較對照組升高（P＜0.05）；使用IL-17 抗體中和干預治療后，DOC+IL-17 抗體組iNOS和Arg1 mRNA 相對表達量較DOC 組降低（P＜0.05）。見圖7和表3。

2.6 各組大鼠IL-17、iNOS 和Arg1 蛋白相對表達量比較

圖7 各組大鼠iNOS 和Arg1 mRNA 的相對表達量比較 （n=10，±s）

表3 各組大鼠iNOS 和Arg1 mRNA 相對表達量比較 （n=10，±s）

表3 各組大鼠iNOS 和Arg1 mRNA 相對表達量比較 （n=10，±s）

組別 iNOS Arg1對照組 1.003±0.051 1.002±0.036 DOC 組 2.302±0.118 1.371±0.041 DOC+IL-17 組 1.351±0.092 1.123±0.062 F 值 556.148 157.140 P 值 0.000 0.000

各組IL-17、iNOS 和Arg1 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）進一步的兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，DOC 組IL-17、iNOS 和Arg1 蛋白相對表達量較對照組升高（P＜0.05）；使用IL-17 抗體中和干預治療后，DOC+IL-17 抗體組iNOS和Arg1 蛋白相對表達量較DOC 組降低（P＜0.05）。見表4和圖8。

表4 各組大鼠IL-17、iNOS 和Arg1 蛋白相對表達量比較 （n=10，±s）

表4 各組大鼠IL-17、iNOS 和Arg1 蛋白相對表達量比較 （n=10，±s）

組別 IL-17 iNOS Arg1對照組 0.924±0.151 3.645±0.456 0.8023±0.346 DOC 組 1.751±0.138 8.785±0.948 2.3472±0.643 DOC+IL-17 組 0.725±0.102 5.864±0.397 0.895±0.507 F 值 163.218 157.515 28.585 P 值 0.000 0.000 0.001

圖8 各組大鼠IL-17、iNOS 和Arg1 蛋白相對表達量比較 （n=10）

3 討論

IL-17 是由Th17 細胞分泌的一種炎癥介質(zhì)，其通過調(diào)節(jié)促炎細胞因子、趨化因子等表達，促進巨噬細胞等炎癥細胞浸潤，從而誘導組織炎癥反應的發(fā)生、放大[9]。MF 過程中存在低度炎癥反應，炎癥反應通過炎癥細胞的聚集、激活，導致心臟成纖維細胞異常增殖，被認為是心室重構(gòu)的起始因子[10-11]。巨噬細胞是心臟主要炎癥細胞，在啟動炎癥反應中發(fā)揮重要作用。健康心臟組織中，巨噬細胞占總細胞數(shù)的1%～5%，但心肌損傷后，其數(shù)量顯著增加[12-13]。巨噬細胞具有高度可塑性和分化潛能，在不同組織微環(huán)境中，可以發(fā)生表型、功能的極化，呈現(xiàn)出不同功能，這是巨噬細胞在MF 中發(fā)揮作用的關(guān)鍵因素[14]。本研究通過復制DOC/鹽誘導的高血壓性大鼠模型，應用IL-17 抗體干預，發(fā)現(xiàn)IL-17 可能通過介導巨噬細胞極化，發(fā)揮促炎和促纖維化作用。

巨噬細胞的亞型受其極化狀態(tài)的調(diào)控，而巨噬細胞不同的亞型在組織中的聚集和激活方式不同[15]。巨噬細胞大致分為2 類：M1 型和M2 型，分別發(fā)揮不同的作用，且其極化狀態(tài)受多種因素調(diào)節(jié)，這對于疾病的治療具有重要意義[16-17]。M1 型特征性表達CD11c，可分泌iNOS、IL-1 等促炎細胞因子，具有細胞毒性，也會導致機體的炎癥損傷，發(fā)揮促炎作用。M2 型高表達CD206，主要分泌Arg1、IL-4 等，起到組織修復等作用[18]。在不同微環(huán)境下，巨噬細胞可激活極化為M1 型或M2 型，不同的表型之間可相互轉(zhuǎn)換[19]。有研究顯示，在心肌缺血早期，以M1 型巨噬細胞募集為主，加速心肌的凋亡，而在心肌缺血中晚期，以M2 型巨噬細胞募集為主，參與MF 的發(fā)生，這表明巨噬細胞的極化狀態(tài)改變是介導巨噬細胞聚集和激活的重要機制[20]。而前期研究均籠統(tǒng)地將各型巨噬細胞混在一起，未充分重視巨噬細胞極化對MF 的重要作用，本研究以CD11c 和CD206 分別標記2 種巨噬細胞，顯示在DOC/鹽誘導的MF 大鼠中，M1 型巨噬細胞和M2 型巨噬細胞均增加，M1 型巨噬細胞增加更加明顯，提示M1 型巨噬細胞在MF 炎癥反應階段發(fā)揮重要作用。

近年來新發(fā)現(xiàn)一類CD4+T 細胞亞群，其功能特征與之前發(fā)現(xiàn)的Th 細胞亞群Th1、Th2 不同，主要分泌IL-17，誘導機體局部組織炎癥反應的發(fā)生、放大和級聯(lián)反應[5，21]。當前探討IL-17 陽性的細胞對免疫炎癥反應的調(diào)控作用已成為研究熱點之一[22-23]。有研究表明，IL-17 參與病毒性心肌炎、肝臟纖維化等多種疾病的病理過程[24]。有報道表明，IL-17 在MF 中發(fā)揮重要作用[25]。其作用機制不明確，是否對影響巨噬細胞的極化尚無報道。有研究提示IL-17 在DOC/鹽誘導的MF 進程中表達水平升高，抑制IL-17 表達能減輕纖維化進程[26]。本研究亦顯示MF 大鼠在IL-17表達增加的同時M1 型巨噬細胞表達同時增加，應用IL-17 抗體干預后，隨著IL-17 減少，M1 型巨噬細胞表達亦減少，心肌間質(zhì)膠原蛋白量同時減少，很可能說明IL-17 通過介導巨噬細胞的極化在MF 中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，在DOC/鹽誘導的MF 大鼠中，IL-17和巨噬細胞表達均增加，發(fā)揮重要作用，伴隨IL-17的中和，M1 型巨噬細胞數(shù)量隨之減少，表明巨噬細胞極化很可能與IL-17 有關(guān)，而IL-17 具體調(diào)控巨噬細胞極化的機制有待進一步研究。