肺泡一氧化氮在間質(zhì)性肺疾病診斷及鑒別中的應(yīng)用價值

常瀟丹，陳美佳，廖畫，董航明，蔡紹曦

南方醫(yī)科大學(xué)1南方醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，2護(hù)理學(xué)院，廣東 廣州510515

間質(zhì)性肺疾病（ILD）是一類主要累及肺間質(zhì)和肺泡腔、導(dǎo)致肺泡-毛細(xì)血管功能單位喪失的彌漫性肺疾病，發(fā)病隱匿，且早期無特異性臨床表現(xiàn)，其主要結(jié)局是氣體交換障礙，導(dǎo)致呼吸困難、運(yùn)動耐受性降低從而影響生活質(zhì)量［1］。其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，大多數(shù)ILD的特征是炎癥或纖維化，或是兩者的組合，需要全面的病史資料、放射學(xué)及病理信息來鑒別和診斷，目前胸部高分辨率CT（HRCT）是關(guān)鍵的檢查手段，特別是在疾病的早期，在超過66%的ILD患者中，利用HRCT結(jié)合臨床表現(xiàn)足以對其做出診斷［2］。結(jié)締組織?。–TD）是一組多系統(tǒng)、多器官受累的自身免疫性疾病，肺是CTD并發(fā)癥的常見發(fā)生部位，肺部受累可表現(xiàn)為多種方式，其中ILD最為多見，CTD相關(guān)ILD（CTD-ILD）見于如系統(tǒng)性硬化?。⊿Sc）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）、多發(fā)性肌炎（PM）/皮肌炎（DM）和干燥綜合征（SS）等多種CTD中［3］，臨床表現(xiàn)為隱匿進(jìn)展或急劇加重時，患者肺功能惡化，顯著影響預(yù)后，甚至危及生命［4］。原發(fā)CTD 病種不一，目前CTD-ILD尚無公認(rèn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時不同ILD的異質(zhì)性使得ILD的準(zhǔn)確識別和診斷面臨挑戰(zhàn)性，某些情況下還需支氣管肺泡灌洗等操作來輔助診斷，積極探索簡單無創(chuàng)的篩查方法及便于疾病鑒別的生物標(biāo)志物是非常有意義的。

一氧化氮（NO）作為血管擴(kuò)張劑、支氣管擴(kuò)張劑和炎癥介質(zhì)發(fā)揮作用，由一氧化氮酶家族（NOSs）生成，根據(jù)功能和發(fā)現(xiàn)的部位，NOS分三種亞型［5］，神經(jīng)型一氧化氮合成酶（nNOS），內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS），前兩者為構(gòu)成型，iNOS在炎癥、免疫激活等條件下經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生NO，主要來源于氣道上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及常駐巨噬細(xì)胞等［6］，在呼出的氣體中可檢測到。有研究發(fā)現(xiàn)通過iNOS產(chǎn)生過多的NO與肺部亞硝酸鹽-氧化應(yīng)激相關(guān)，并促進(jìn)ILD小鼠模型的異常纖維化過程［7］。eNO分析儀可以對NO濃度進(jìn)行檢測，目前呼出氣一氧化氮（FeNO）已廣泛運(yùn)用于哮喘的診療和疾病管理，發(fā)揮著重要的臨床價值。多流速NO檢測能夠相對區(qū)分支氣管和肺泡來源的NO，肺泡一氧化氮（CaNO）通過雙室模型計算得出［8］，目前已有研究探索其在哮喘、慢性阻塞性肺病及閉塞性細(xì)支氣管炎等疾病中的臨床運(yùn)用［9-14］。研究發(fā)現(xiàn)CaNO值反映了自身免疫性肺泡蛋白增多癥中的肺泡炎癥［15］，SSc患者合并ILD時CaNO明顯高于單純SSc患者，提示CaNO在ILD中有潛在的應(yīng)用價值［16］。本研究通過比較ILD患者和健康人eNO參數(shù)的差異，以及ILD中CTD-ILD患者和非CTD-ILD患者eNO參數(shù)的差異，并分析eNO與其他肺功能指標(biāo)的相關(guān)性，探究eNO在初步診斷ILD及鑒別CTD-ILD和非CTD-ILD中的應(yīng)用價值。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選擇2021年11月～2022年10月在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科肺功能室就診的ILD患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：HRCT出現(xiàn)網(wǎng)格狀、蜂窩狀、磨玻璃影、牽引性支氣管擴(kuò)張或支氣管膨大等肺間質(zhì)病變影像學(xué)表現(xiàn)［15］，經(jīng)影像科及呼吸科醫(yī)師共同判定；完成肺通氣功能檢查，表現(xiàn)為限制性通氣功能障礙和（或）彌散功能障礙；完成多流速eNO檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：確診支氣管哮喘或合并有哮喘的患者；社區(qū)獲得性肺炎、肺結(jié)核患者；eNO檢測時過去4周內(nèi)有過敏性鼻炎發(fā)作史；eNO檢測時過去4周內(nèi)有全身糖皮質(zhì)激素或吸入性糖皮質(zhì)激素者。選取健康者為對照組，既往無哮喘、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張癥等慢性呼吸系統(tǒng)疾病病史，測試時不合并呼吸道感染性疾病。

本研究以CaNO作為主要評價指標(biāo)，利用PASS15對研究中所需樣本量進(jìn)行計算，運(yùn)用預(yù)實驗的研究結(jié)果，獨立樣本t檢驗差異分析μ1=6.38±3.12，μ2=3.85±1.45，取R=1.5，α=0.05（雙側(cè)），β=0.10，計算樣本量為N1=34例，ILD組至少需要被試者34名；N2=52例，健康組至少需要被試者52名。本研究ILD組納入被試者45名，健康組納入被試者68名。

收集并分析入組患者人口統(tǒng)計學(xué)和臨床數(shù)據(jù)，包括年齡、性別、BMI、吸煙史、肺功能檢測結(jié)果和eNO測量結(jié)果，在本研究中CaNO結(jié)果小于1時記作1ppb。本研究已通過南方醫(yī)院倫理委員會的倫理批準(zhǔn)[編號NFEC-2021-397]。

1.2 檢測方法

多流速eNO檢測：嚴(yán)格按照2005年ATS/ERS技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)［16］以及2017年ERS呼氣標(biāo)志物測定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)［6］，使用Sunvou醫(yī)療電子公司納庫侖一氧化氮分析儀，患者在專業(yè)人員指導(dǎo)下進(jìn)行eNO檢測，儀器分析完成后自動生成測試報告，如受試者呼氣期間出現(xiàn)漏氣、換氣、憋氣或噴出口水的情況，立即終止測試，待受試者恢復(fù)靜息狀態(tài)后，重新進(jìn)行測試。FeNO是一個與呼氣流速相關(guān)的指標(biāo)，流速越小則越能反映大氣道中NO濃度水平，反之流速越高則越能反映小氣道中的NO濃度水平，在呼氣流速為50 mL/s和200 mL/s時分別檢測eNO濃度，記作FeNO50、FeNO200，CaNO根據(jù)上述FeNO測量得到的數(shù)據(jù)，通過“two-compartment model”（雙室模型）由儀器計算后得出，代表肺泡NO濃度。檢測前1 h受試者不得飲食、抽煙、劇烈運(yùn)動或進(jìn)行肺功能試驗，檢測前3 h內(nèi)不得食用西蘭花、芥藍(lán)、生菜、萵苣、芹菜、水蘿卜以及熏或腌制類食品。肺功能檢測：根據(jù)ATS/ERS標(biāo)準(zhǔn)記錄由德國Jaeger公司的肺功能儀檢測的結(jié)果，第1秒用力呼氣容積占其預(yù)計值的百分比（FEV1%pre），用力呼氣容積占其預(yù)計值的百分比（FVC%pre），第1秒用力呼氣容積占用力呼氣容積的百分比（FEV1/FVC），肺一氧化碳彌散量占預(yù)計值的百分比（DLCO%pred），用力呼出50%肺活量時的平均呼氣流速（MEF50），最大呼氣中期流量（MMEF），以及用力呼出75%肺活量時的平均呼氣流速（MEF25）。

1.3 分析指標(biāo)

比較健康組與ILD組及ILD亞組間eNO差異；分析發(fā)生ILD的有效預(yù)測指標(biāo)；分析ILD組eNO與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性，探討CaNO在評估ILD患者肺功能損傷中的作用。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料中符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，不符合正態(tài)分布的用中位數(shù)（第一四分位數(shù)，第三四分位數(shù)）描述；計數(shù)資料以頻數(shù)或百分比表示。兩組正態(tài)分布計量資料組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布計量資料兩樣本比較采用Mann-WhitneyU檢驗。多組計數(shù)資料比較采用Pearson χ2檢驗。預(yù)測指標(biāo)分析采用二元logistic回歸進(jìn)行分析。采用ROC分析并計算AUC探討CaNO指標(biāo)用于診斷ILD的價值以及鑒別CTD-ILD的價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ILD組與健康對照組患者一般資料比較

共納入45例ILD患者，其中男性25例，女性20例，患者年齡為55.25±13.88歲，其中有吸煙史者17例，無吸煙史者28例，其中特發(fā)性的間質(zhì)性肺炎（IIP）11例；納入68名健康者，男性32名，女性36名，年齡為51.44±8.34歲，其中有吸煙史者40名，無吸煙史者28名。各組間年齡、性別、吸煙史、BMI一般人口學(xué)資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。eNO指標(biāo)比較，ILD組患者的CaNO、FeNO50、FeNO200的水平均高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 eNO參數(shù)FeNO50、FeNO200和CaNO在健康組（n=68）和ILD組（n=45）中的比較Fig. 1 Comparison of eNO levels between healthy control subjects(n=68)and ILD patients(n=45).*P＜0.05.

表1 健康組和間質(zhì)肺組一般資料Tab.1 Baseline characteristics of patients with interstitial lung disease and healthy control sujects

2.2 分析發(fā)生ILD的有效預(yù)測指標(biāo)

根據(jù)單因素二元Logistic回歸分析（表2），F(xiàn)eNO50、FeNO200和CaNO在鑒別健康者和ILD中具有統(tǒng)計學(xué)意義。進(jìn)行共線性診斷后結(jié)果顯示，變量間存在多重共線性。通過Logistic 逐步回歸法進(jìn)行修正，結(jié)果顯示FeNO200升高（OR=1.2，95%CI：1.042～1.382）、CaNO升高（OR=1.570，95%CI：1.235～1.996），診斷ILD的可能性越大（表3）。根據(jù)回歸分析構(gòu)建的預(yù)測模型進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示鑒別健康者和ILD的AUC為0.829（95%CI為0.752～0.906，P＜0.001），提示該模型具有良好的預(yù)測價值（圖2）。敏感性為82.2%，特異性為54.3%。

圖2 基于Logistic回歸模型的ROC曲線Fig. 2 ROC curve based on the logistic regression model.

表2 ILD組和健康組基于一般資料和eNO指標(biāo)的單因素二元Logistic回歸分析Tab.2 Univariate binary logistic regression in ILD group and healthy control group based on general clinical data and eNO indicators

表3 ILD組和健康組基于一般資料和eNO指標(biāo)的多因素二元Logistic回歸分析Tab.3 Multivariate binary logistic regression in ILD group and healthy control group based on general information and eNO indicators

2.3 ILD患者肺功能參數(shù)與eNO相關(guān)性分析

在ILD患者中，39例患者完成肺彌散功能檢測，散點圖提示ILD組DLCO%pred值與FeNO50水平之間無相關(guān)性(r=0.068，P＞0.05)，而DLCO%pred 值與CaNO水平散點圖提示兩者有線性關(guān)系，呈負(fù)相關(guān)（r=-0.471，P＜0.05，圖3）。以小氣道有無障礙（MEF50、MMEF、MEF25實際值/預(yù)計值，三者中任意兩個＜65%）分組，小氣道功能障礙組（n=21）FeNO50、CaNO 分別為19.38±8.9 ppb、5.65±3.34 ppb，小氣道功能無障礙組（n=24）FeNO50、CaNO分別為21.08±7.9 ppb、5.06±2.04 ppb，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 ILD患者中CaNO與DLCO%pred相關(guān)性分析Fig. 3 Correlation analysis between CaNO and DLCO%pred in ILD patients.

2.4 在ILD患者中，CTD-ILD組與非CTD-ILD組比較

CTD-ILD組中18例患者（包括干燥綜合癥3例，皮肌炎8例，系統(tǒng)性硬皮病3例，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎2例，混合性結(jié)締組織病2例），男性11例，女性7例，患者年齡為52.33±2.63歲；納入27例非CTD-ILD患者，男性11例，女性16例，平均年齡為57.20±2.95歲。兩組間年齡、性別、BMI等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性（表4）。eNO指標(biāo)比較，CTD-ILD組患者的CaNO的水平高于非CTD-ILD組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

圖4 eNO參數(shù)FeNO50、FeNO200和CaNO在CTD-ILD組（n=18）和非CTD-ILD組（n=27）的比較Fig. 4 Comparison of eNO levels between CTD-ILD patients(n=18)and non-CTD-ILD(n=27).

表4 CTD-ILD組和非CTD-ILD組一般資料和肺功能比較Tab.4 Comparison of general information and pulmonary function between CTD-ILD and non-CTDILD groups

2.5 CaNO鑒別CTD-ILD和ILD的敏感度和特異度

CTD-ILD患者CaNO水平高于非CTD-ILD患者，CaNO 鑒別CTD-ILD 和非CTD-ILD 的AUC 為0.725[95%CI為0.576～0.875，P=0.011]，其最佳臨界值為6.65 ppb，鑒別CTD-ILD 和非CTD-ILD 的敏感性為50%，特異性為81.6%（圖5）。

圖5 CaNO鑒別CTD-ILD分型和非CTD-ILD分型的ROC曲線Fig. 5 ROC curve of CaNO for differential diagnosis between CTD-ILD and non-CTD-ILD.

3 討論

本研究分析比較了ILD患者與健康人的eNO參數(shù)，及CaNO作為ILD嚴(yán)重程度及小氣道功能評估標(biāo)志物的可能性，并探索了CTD-ILD患者與非CTD-ILD患者的eNO參數(shù)和肺功能指標(biāo)的特點，評價了eNO這種無創(chuàng)、可重復(fù)性高的檢測技術(shù)在ILD中的潛在應(yīng)用價值。

本研究的目的是確定eNO參數(shù)在ILD診斷中的潛在作用，結(jié)果顯示ILD 患者在FeNO 流速為50 mL/s、200 mL/s 的值以及CaNO值，均高于健康對照組。Logistic回歸結(jié)果顯示FeNO200聯(lián)合CaNO對ILD的初步診斷有較好的價值。Cameli等［20］在健康者與特發(fā)性肺纖維化（IPF）患者中比較流速50 mL/s、100 mL/s和150 mL/s時eNO的水平，結(jié)果顯示IPF患者eNO結(jié)果高于健康者。本研究首次使用國產(chǎn)儀器常規(guī)設(shè)置的50mL/s、200 mL/s流速觀察ILD患者eNO水平，結(jié)果與上述研究一致。此學(xué)者在另一項研究中驗證CaNO用于IPF疾病預(yù)后的價值，生存分析結(jié)果顯示，CaNO≥6 ppb的患者預(yù)后顯著較差［21］。NO被認(rèn)為是上皮細(xì)胞傷口愈合和修復(fù)過程中的一個關(guān)鍵介質(zhì)，原因是參與這些機(jī)制的成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞等在被激活時能夠通過不同的途徑產(chǎn)生NO［22,23］。有研究報道NO直接參與肺纖維化，證明博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型的支氣管肺泡灌洗液中硝酸鹽和亞硝酸鹽的產(chǎn)生增加，與iNOS的顯著過表達(dá)相關(guān)［24］。ILD患者CaNO水平高于健康人，可能與在肺纖維化受累階段iNOS被激活，促進(jìn)NO產(chǎn)生，進(jìn)一步加強(qiáng)了肺部炎癥和纖維生成有關(guān)［25］。在一項對COVID-19感染出院后3個月患者的研究中，發(fā)現(xiàn)肺部CT存在磨玻璃結(jié)節(jié)的患者CaNO值更高，其次是CT提示有纖維化改變的患者，這可能也提示NO參與肺纖維化的發(fā)生［26］。目前NO在肺纖維化發(fā)生過程中的作用及機(jī)制仍存在爭議，需要更多的研究探索其如何影響肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。

值得注意的是，當(dāng)分析eNO參數(shù)與肺彌散功能的關(guān)系時，本研究發(fā)現(xiàn)，CaNO與DLCO%pred水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，有研究［21］在IPF患者中發(fā)現(xiàn)CaNO與肺一氧化氮彌散因子相關(guān)。DLCO%pred不僅是評估肺彌散能力的指標(biāo)，也是評估ILD預(yù)后重要的指標(biāo)之一。有研究表明［10］，CaNO有作為反映NO通過肺泡毛細(xì)血管膜擴(kuò)散功能標(biāo)志物的潛在功能，由于肺泡毛細(xì)血管膜增厚而導(dǎo)致的進(jìn)行性損害減少了肺泡腔中NO的排出，導(dǎo)致NO潴留，可能與肺部損害程度成正比，也有學(xué)者［27］研究結(jié)果表明肺泡內(nèi)NO生成的增加嚴(yán)重影響肺泡擴(kuò)散功能，從而促進(jìn)肺泡進(jìn)行性損害。CaNO和肺彌散功能之間的相關(guān)性提示CaNO可能作為反應(yīng)肺泡彌散功能的潛在標(biāo)志物，在ILD患者病情嚴(yán)重程度評估中發(fā)揮作用，在臨床中eNO檢測與肺功能檢查聯(lián)合使用有助于醫(yī)生更好的判斷ILD患者的肺功能情況。越來越多的研究［11,28,29］開始關(guān)注NO在小氣道中的應(yīng)用，有結(jié)果提示CaNO是反映外周小氣道炎癥的敏感指標(biāo)，同時有研究發(fā)現(xiàn)CaNO升高可能提示小氣道障礙。我們的研究在ILD患者中以小氣道有無障礙分組，未發(fā)現(xiàn)小氣道功能障礙組CaNO值高于小氣道功能無障礙組，可能因為不同研究間疾病構(gòu)成的異質(zhì)性，后續(xù)需要更大樣本量研究探索CaNO是否可以靈敏的反應(yīng)ILD患者的小氣道功能。

本研究的另一個目的是分析在ILD中，CaNO區(qū)別CTD-ILD和非CTD-ILD的潛在價值。此前已有研究探索FeNO在鑒別不同亞型的ILD之間是否具有價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FeNO可作為鑒別慢性過敏性肺炎與其他類型肺纖維化的工具［30］。在SSc合并ILD和未合并ILD的患者中探索CANO的應(yīng)用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CANO是診斷SSc患者ILD的一個潛在生物標(biāo)志物，與HRCT聯(lián)合評估可以發(fā)揮更好的效果［31］。本研究在探究CaNO的鑒別價值中發(fā)現(xiàn)，與其他ILD相比，CTD-ILD患者的CaNO水平更高，這一發(fā)現(xiàn)可能與這些CTD中發(fā)生更明顯的炎癥過程刺激了肺組織中iNOS的異常過表達(dá)有關(guān)［32］，這提示CaNO可能可作為鑒別CTD-ILD和非CTD-ILD的工具。許多ILD患者具有自身免疫性的臨床表現(xiàn)或血清學(xué)特征，但沒有達(dá)到CTD的明確診斷，或報告肺纖維化是CTD 的第一表現(xiàn)。因此，探索新的工具鑒別CTD-ILD與非CTD-ILD患者是至關(guān)重要的。

本研究首次探索了在國內(nèi)人群中eNO檢測對ILD的潛在診斷作用，但仍存在一定的局限性，樣本量較小，為回顧性的單中心研究，結(jié)果可能存在偏倚，希望未來能夠進(jìn)行大樣本的多中心前瞻性研究，進(jìn)一步探索驗證CaNO在ILD患者鑒別診斷中的作用，以期將CaNO廣泛應(yīng)用于ILD患者的鑒別診斷以及肺功能損傷嚴(yán)重程度、小氣道功能的評價。

綜上所述，CaNO的作用可能不止于輔助ILD的診斷，在鑒別CTD-ILD、評估肺部損傷程度上也具有較大的潛在應(yīng)用價值，且多流速檢測聯(lián)合使用具有較為理想的診斷價值。eNO檢測具有可重復(fù)性、操作簡單等優(yōu)點，有助于疾病管理，值得在臨床實踐中研究和推廣。