轉(zhuǎn)錄組測序在林草植物抗逆性研究中的應(yīng)用

高慧娟，呂昕培，王潤娟，任偉，程濟(jì)南，汪永平，邵坤仲，張金林

(蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020，甘肅 蘭州730020)

功能基因組學(xué)中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從整體mRNA水平上研究特定組織或細(xì)胞在不同發(fā)育階段，不同狀態(tài)下功能基因的表達(dá)情況和調(diào)控機(jī)理，以闡明生物表型與功能[1-2]。自1977年Sanger法測序技術(shù)誕生，以末端終止法為核心的傳統(tǒng)的第一代測序技術(shù)主導(dǎo)了DNA測序近30年，但是Sanger法測序通量低，準(zhǔn)確度不高，價格昂貴，在應(yīng)用過程中有很多缺陷[3-4]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA微陣列(DNA microarray)、DNA宏陣列(DNA macroarray)、基因表達(dá)系列分析(serial analysis of gene expression, SAGE)、大規(guī)模平行測序技術(shù)(massively parallel signature sequencing, MPSS)以及使用最廣泛的第二代測序技術(shù)(next-generation sequencing technologies, NGS)即高通量測序技術(shù)(RNA-seq)相繼產(chǎn)生[5-6]。二代測序技術(shù)自2005年被引入市場，逐漸替代了Sanger法并對基因組學(xué)的研究產(chǎn)生了深刻的影響[7]。相比于傳統(tǒng)的測序方法，以Illumina/Solexa測序、Roche/454測序及ABI/SOLiD測序?yàn)橹鞯腞NA測序技術(shù)(RNA-seq)測序時間短、成本低、準(zhǔn)確性高、高通量等，還可以獲得低豐度的表達(dá)基因，亦可用于未知基因組序列的物種研究，因此被大規(guī)模的用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域[8-11](表1)。該技術(shù)可以高通量的直接對mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA進(jìn)行測序，揭示特定細(xì)胞或組織中表達(dá)的全部轉(zhuǎn)錄本；通過不同處理間基因表達(dá)差異的比較，還可獲得轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量，確定轉(zhuǎn)錄發(fā)生位點(diǎn)，繪制轉(zhuǎn)錄圖譜，預(yù)測一些基因模型和組蛋白修飾，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化分析等[12-14]?；蚪M已知物種，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果通過與其基因組比對，可以獲得基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化和基因可變剪切，發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本，檢測基因融合；無參考基因組的物種，通過測序組裝(Denovoassembly)可獲得單一基因序列，并通過功能比對獲得基因信息，包括基因表達(dá)量及差異表達(dá)基因研究，還可檢測轉(zhuǎn)錄水平的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)和簡單重復(fù)序列遺傳標(biāo)記(simple sequence repeat,SSR)等[13-14]。近年來，RNA-seq在動植物發(fā)育調(diào)控, 免疫互作, 表觀調(diào)控以及逆境響應(yīng)上的應(yīng)用也越來越廣[15]。在植物抗逆方面，RNA-seq技術(shù)的應(yīng)用能全面動態(tài)地檢測逆境下植物體基因在各個時空下的表達(dá)變化，并挖掘功能基因，分析脅迫響應(yīng)調(diào)控機(jī)制，為植物抗逆機(jī)理研究，培育抗逆品種提供分子遺傳基礎(chǔ)[16-17]。本研究詳細(xì)總結(jié)了近年來國內(nèi)外有關(guān)RNA-seq技術(shù)在林草植物抗逆方面的應(yīng)用。

表1 DNA測序技術(shù)的發(fā)展

1 生物脅迫下林草植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展

1.1 真菌性病害脅迫下林草植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

Barakat等[18]用454測序技術(shù)比較了栗疫病感染下美國板栗(Castaneamollissima)和抗病型中國板栗的基因表達(dá)情況。通過測序組裝各自產(chǎn)生了28890和40039個Unigenes，GO注釋表明大多基因都富集在生物與非生物刺激響應(yīng)、細(xì)胞組織、生物進(jìn)程、轉(zhuǎn)移酶和水解酶代謝方面。栗疫病感染下一些與抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和生物脅迫響應(yīng)基因在中國板栗中發(fā)生了差異表達(dá)，其中有一些已被報道參與植物病原體防御反應(yīng)，包括過敏性反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞死亡以及阻止病原體進(jìn)入細(xì)胞的物理屏障的構(gòu)建，這些可能是導(dǎo)致兩種板栗抗病性差異的主要原因。Wu等[19]利用Solexa技術(shù)對霜霉病感染下的葡萄(Vitisvinifera)葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析，正常條件下獲得了203514個Unigenes，霜霉病感染下獲得了233653個Unigenes；通過基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，感病葉片中0.9%的Unigenes表達(dá)上調(diào)了5倍以上，0.6%的Unigenes表達(dá)下調(diào)5倍以上，且上調(diào)基因主要富集在核糖體結(jié)構(gòu)、氨基酸和糖代謝通路中，這些差異基因以及代謝、信號通路可能與葡萄的抗病性密切相關(guān)。Wang等[20]利用Solexa測序技術(shù)研究了尖孢鐮刀菌感染(0、2、4和6 d)下香蕉(Musanana)根部基因表達(dá)情況，組裝獲得了平均長度為1439 bp的25158個Unigenes，通過序列相似性比較，21622(85.94%)個Unigenes得到注釋，真菌感染下與苯丙氨酸代謝、苯丙烷合成以及亞麻酸代謝途徑相關(guān)的基因發(fā)生了差異表達(dá)，這些可能與香蕉抗病性密切相關(guān)。同年，Li等[21]利用RNA-seq技術(shù)比較了尖孢鐮刀菌侵染下兩種不同抗性香蕉(變異卡文迪香蕉和野生型香蕉)間的基因表達(dá)變化，共獲得了平均長度為554 bp的88161個Unigenes，其中5008個基因與植物病害防御和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)；基因表達(dá)譜(gene expression profile，DGE)分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞壁修飾基因以及與免疫激活、激素合成、病害防御相關(guān)的基因的表達(dá)在二者間有很大差異，導(dǎo)致了香蕉的抗病性的不同。稻瘟菌感染下水稻(Oryzasativa)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和次生代謝反應(yīng)的基因表達(dá)急劇上調(diào)，尤其是WRKY轉(zhuǎn)錄因子。已知OsWRKY的過表達(dá)可以增強(qiáng)水稻的抗病性，更加說明WRKY在水稻抗稻瘟菌反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[22]。輪狀鐮刀菌會引起玉米(Zeamays)穗腐病，降低籽粒產(chǎn)量。Wang等[23]對鐮刀菌有較高抗性的玉米柱系進(jìn)行了RNA測序分析，發(fā)現(xiàn)熱激蛋白類、次級代謝物(苯丙酸、木質(zhì)素、香豆酸、類黃酮)以及脫落酸、茉莉酸、水楊酸信號通路在玉米抵抗真菌感染過程中發(fā)揮重要作用。Sun等[24]對水稻條銹病感染下的擬南芥(Arabidopsisthaliana)進(jìn)行了RNA測序分析，總共檢測到624個差異表達(dá)基因，在感染14 d后，有255個基因上調(diào)，38個下調(diào)，感染21 d后，146個基因上調(diào)，237個下調(diào)，其中只有52個基因在整個感染期間均差異表達(dá)。即在感染早期(14 d)，與宿主防御反應(yīng)相關(guān)的基因被誘導(dǎo)表達(dá)，而到后期(21 d)表達(dá)被抑制。功能注釋發(fā)現(xiàn)這些基因與植物防御反應(yīng)、次生代謝及蛋白質(zhì)磷酸化相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)大白菜(Brassicapekinensis)R635-10不易感染十字花科根腫病菌，而S177-47極易感染根腫病菌，Jia等[25]對這兩個品種進(jìn)行了RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)R635-10感染病菌后，有2089個基因差異表達(dá)，其中與鈣離子內(nèi)流、葡糖異硫氰酸鹽合成、細(xì)胞壁增厚、水楊酸穩(wěn)態(tài)及幾丁質(zhì)代謝相關(guān)的基因都上調(diào)表達(dá)。S177-47感染病菌后有10038個基因差異表達(dá)，其中與三羧酸循環(huán)、DNA復(fù)制、氧化磷酸化、細(xì)胞壁擴(kuò)張、根瘤素、吲哚乙酸和細(xì)胞分裂素相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)，這些基因主要參與了細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂及能量合成和轉(zhuǎn)換過程；而細(xì)胞分裂和擴(kuò)張基因在R635-10中被抑制表達(dá)，說明在S177-47中根細(xì)胞分裂失去調(diào)控導(dǎo)致了根的腫脹。

1.2 細(xì)菌性病害脅迫下林草植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

Martinelli等[26]通過RNA-seq研究黃龍病感染下柑橘(Citrusreticulata)的轉(zhuǎn)錄組變化情況。黃龍病感染下，幾個WRKY轉(zhuǎn)錄因子、與光合作用光反應(yīng)、ATP合成、乙烯通路、蛋白降解和錯誤折疊相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)；而與細(xì)胞分裂素和赤霉素合成以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因表達(dá)受到抑制。通路分析發(fā)現(xiàn)，與源庫運(yùn)輸相關(guān)的蔗糖和淀粉代謝，以及激素合成和信號通路發(fā)生了改變。這些結(jié)果說明了黃龍病感染下柑橘的基因響應(yīng)情況，為以后減緩發(fā)病提供了廣泛的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。龍葵(Solanumnigrum)對青枯雷爾氏菌引起的青枯病有較強(qiáng)的抗性，Zuluaga等[27]對青枯病感染下的龍葵F118(抗病)和F97(易感病)進(jìn)行了RNA測序分析，在F118和 F97中分別有221和644個基因發(fā)生差異表達(dá)，其中上調(diào)表達(dá)基因中有1/2已被報道參與植物病原反應(yīng)。乙烯和水楊酸相關(guān)基因只在F118中被誘導(dǎo)表達(dá)，茉莉酸相關(guān)基因在F118和 F97中均表達(dá)下調(diào)，這為以后龍葵抗青枯病研究提供了重要的分子基礎(chǔ)。根際有益菌能提高植物對病原菌的抵抗力，Van de Mortel等[28]對熒光假單孢菌SS101 (Pf. SS101)在擬南芥抵抗細(xì)菌性斑點(diǎn)病反應(yīng)中的功能進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)熒光假單孢菌能夠增強(qiáng)植株對細(xì)菌性斑點(diǎn)病的抗性，通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，其他根際細(xì)菌一般通過乙烯信號來提高植物防御能力，而Pf. SS101是依靠水楊酸信號來提高植物抗病能力，尤其葡糖異硫氰酸鹽和植保素是Pf. SS101誘導(dǎo)植物抗細(xì)菌性斑點(diǎn)病必不可缺的次級代謝物。

1.3 蟲害脅迫下林草植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

大豆包囊線蟲(soybean cyst nematode, SCN)寄生于豆類植物根部，對豆類生長和種子產(chǎn)量造成嚴(yán)重危害。變異山羊草(Triticumtriunciale)對包囊線蟲具有一定的抗性，由于基因組信息的缺乏，相關(guān)抗蟲功能基因研究受到限制。Xu等[29]運(yùn)用RNA-seq對包囊線蟲感染下的山羊草根部組織進(jìn)行測序，獲得了平均長度為500 bp的118064個Unigenes。功能分類發(fā)現(xiàn)7408個Unigenes與植物防御和抗性有關(guān)，包括“植物病原互作”“磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)”和“ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體”，這為抗蟲基因篩選以及山羊草抗包囊線蟲分子機(jī)制研究提供了一定的基礎(chǔ)。Jain等[30]對SCN感染下的兩種黑白斑豆(Glycinemax), PI533561(抗SCN)和GTS-900(易感染SCN)進(jìn)行了RNA測序分析，發(fā)現(xiàn)PI533561感染SCN后有353個基因發(fā)生差異表達(dá)，其中154個上調(diào)表達(dá)，GTS-900感染SCN后有990個基因發(fā)生差異表達(dá)，406個上調(diào)表達(dá)。其中，WRKY、病程相關(guān)蛋白和熱激蛋白基因均發(fā)生差異表達(dá)，光合反應(yīng)均被抑制。黑豆(Glycinemax)對SCN具有較強(qiáng)的抗性，Li等[31]通過RNA測序分析了灰皮支黑豆對SCN的抗病機(jī)制。發(fā)現(xiàn)在SCN侵染5、10和15 d后灰皮支黑豆根部分別有740、1413和4925個基因發(fā)生了差異表達(dá)，其中有225(3個下調(diào))個基因在整個時間段均差異表達(dá)。且大多數(shù)基因與植物防御以及激素信號相關(guān)，為了驗(yàn)證激素信號在灰皮支黑豆抵抗SCN中的作用，對灰皮支黑豆進(jìn)行了生長素、赤霉素、水楊酸、茉莉酸以及乙烯處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)激素處理能夠顯著提高灰皮支黑豆對SCN的抗性。芽孢桿菌Sneb545能提高大豆(Glycinemax)對SCN的抗性，Kang等[32]通過轉(zhuǎn)錄組測序?qū)?jīng)過Sneb545處理的大豆響應(yīng)SCN的防御機(jī)制進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)與未處理的大豆相比，Sneb545處理的大豆中有大量的殺線蟲代謝物，包括4-乙烯基苯酚、蛋氨酸、胡椒堿和棕櫚酸，這些代謝物增強(qiáng)了大豆的抗病性。

1.4 病毒性病害脅迫下林草植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

Rubio等[33]利用Solexa技術(shù)分析李痘病毒感染下桃樹(Amygdaluspersica)葉片的基因表達(dá)變化。沒有癥狀發(fā)生的葉片，初期伴隨有腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)生，且與茉莉酸、幾丁質(zhì)酶以及細(xì)胞分裂素等相關(guān)的基因發(fā)生差異表達(dá)。有痘病癥狀的樣品中，有一部分基因比對到病毒參考基因組。GO注釋表明與生物刺激響應(yīng)，脂類和碳水化合物代謝有關(guān)的基因發(fā)生了差異表達(dá)。此次結(jié)果闡明了轉(zhuǎn)錄水平下桃樹感病和抗病的分子機(jī)制的不同。馬鈴薯(Solanumtuberosum)病毒病對馬鈴薯產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響，不同馬鈴薯品種對病毒病的響應(yīng)有很大差異。Goyer等[34]通過RNA測序比較了兩個馬鈴薯品種Premier Russet和Russet Burbank在病毒病(PVY)感染下的基因表達(dá)變化。Premier Russet栽培種對PVYO有抗性，但易感染PVYNTN，Russet Burbank易感染PVYNTN和PVYO。結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染4 d后，大多數(shù)基因下調(diào)表達(dá)，感染10 d后，大多數(shù)基因上調(diào)表達(dá)。Premier Russet感染PVYO反應(yīng)中，差異表達(dá)基因大多與光合作用中的光捕獲相關(guān)，Premier Russet感染PVYNTN和Russet Burbank感染PVYO反應(yīng)中，差異表達(dá)基因大多與核小體組裝有關(guān)。這些基因中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、MYC2 、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶基因只有在Premier Russet感染PVYO反應(yīng)中下調(diào)表達(dá)，說明這些基因的表達(dá)決定了馬鈴薯對PVY的抗病能力的強(qiáng)弱。Rodamilans等[35]對李痘病毒感染下的歐洲李(Prunusdomestica)進(jìn)行了RNA測序分析，總共有3020個基因發(fā)生差異表達(dá)，其中與植物防御相關(guān)的基因大多都上調(diào)，而光合相關(guān)基因都下調(diào)表達(dá)。上調(diào)基因中有10個是核苷酸結(jié)合位點(diǎn)-富含亮氨酸重復(fù)基因(NBS-LRR)，NBS-LRR在文獻(xiàn)中多有報道參與植物抗病反應(yīng)[18,21,26]。

總的來說，通過RNA測序，我們可以分析病蟲侵害下植物基因表達(dá)變化，從而篩選出一些病蟲害響應(yīng)基因；也可以通過比較兩個不同抗性品種在生物脅迫前后的基因表達(dá)差異，直接鑒定出病蟲害防御基因，探究抗病機(jī)理。植物對真菌、細(xì)菌、蟲害以及病毒的響應(yīng)機(jī)理大多是相通的，尤其一些苯丙氨酸、蛋氨酸、甲硫氨酸、轉(zhuǎn)錄因子(WRKY)、激素(脫落酸、茉莉酸、水楊酸、乙烯)、熱激蛋白、次級代謝物(苯丙酸、香豆酸、類黃酮、胡椒堿、棕櫚酸、葡糖異硫氰酸鹽和植保素)、NBS-LRR、細(xì)胞壁修飾基因(幾丁質(zhì)和木質(zhì)素)以及植物防御相關(guān)基因在植物應(yīng)對生物脅迫過程中發(fā)揮重要功能。

2 非生物脅迫下林草植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

2.1 鹽脅迫下林草植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

胡楊(Populuseuphratica)是一種耐鹽模式植物，Qiu等[36]利用Solexa技術(shù)對鹽處理前后(100 mmol·L-1NaCl)胡楊進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，組裝獲得了86777個Unigenes，27%的Unigenes發(fā)生差異表達(dá)，且它們主要參與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脫落酸(abscisic acid，ABA)調(diào)節(jié)以及生物合成等反應(yīng)，這為以后胡楊鹽脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。Chen等[37]利用Solexa技術(shù)分析高耐鹽紅樹植物杯萼海桑(Sonneratiaalba)在鹽處理下(250 mmol·L-1NaCl)的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況, 組裝獲得了平均長度為581 bp的30628個Unigenes，鑒定了2358個SSR標(biāo)記，基因功能注釋發(fā)現(xiàn)與線粒體、碳代謝和次生代謝相關(guān)的基因參與了海桑的鹽適應(yīng)過程。另外，通過與已知的273個其他物種中的鹽響應(yīng)基因比對，在海桑中篩選出了1266個的耐鹽候選基因。將杯萼海桑轉(zhuǎn)錄組序列與其他同種海桑的表達(dá)系列標(biāo)簽(expressed sequence tags, EST)比較，鑒定了4個具有較強(qiáng)自然選擇標(biāo)記的基因，這為海桑耐鹽機(jī)理及遺傳多樣性研究提供了豐富的理論依據(jù)。Chen等[38]利用Solexa和DGE技術(shù)分析鹽處理下小葉楊(Populussimonii)的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)變化，在3、6和9 d的鹽處理下分別檢測到了5453、2372和1770個差異表達(dá)基因，GO功能分析表明大多數(shù)差異表達(dá)基因與物質(zhì)運(yùn)輸和逆境響應(yīng)相關(guān)。Huang等[39]利用Solexa測序技術(shù)研究鹽處理下半紅樹植物水黃皮(Pongamiapinnata)的轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)情況，獲得了平均長度為606 bp的108598個Unigenes，54596(50.3%)個Unigenes獲得注釋，鹽處理下檢測到了23815個顯著差異表達(dá)基因，這些基因的功能富集分析顯示出組織特異性，根中的差異表達(dá)基因數(shù)多于葉中。2013年，Ma等[40]又利用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行了鹽處理下(200 mmol·L-1NaCl)胡楊根、葉和毛白楊(Populustomentosa)愈傷組織的基因表達(dá)分析，分別檢測到 6727、3954和3733個差異表達(dá)基因，許多與陽離子運(yùn)轉(zhuǎn)以及氧化還原酶相關(guān)的基因在胡楊中特異表達(dá)，這可能導(dǎo)致了二者之間的耐鹽性差異。兩個甜瓜(Cucumismelo)品種玉露和冰雪脆在300 mmol·L-1NaCl下的生理參數(shù)存在差異，陳嘉貝等[41]利用Solexa測序技術(shù)檢測它們在NaCl處理下的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)玉露共有56個轉(zhuǎn)錄因子基因發(fā)生差異表達(dá)(22個上調(diào)表達(dá)，34個下調(diào)表達(dá))，冰雪脆有47個轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生差異表達(dá)(17個上調(diào)表達(dá)，30個下調(diào)表達(dá))。轉(zhuǎn)錄因子表現(xiàn)出一定的品種特異性，兩品種間也有部分重疊。趙航等[42]利用RNA-seq技術(shù)分析鹽處理下(600 mmol·L-1NaCl)鹽穗木(Halostachyscaspica)基因表達(dá)情況，并分析其相應(yīng)的響應(yīng)方式。研究獲得了大量的差異表達(dá)基因，通過分類匯總，得到23組與耐鹽相關(guān)的基因類群，包括檸檬酸合成酶、蛋白激酶、WRKY成員等，這與鹽穗木的耐鹽性密切相關(guān)。Joann等[43]利用RNA-seq技術(shù)研究鹽脅迫下堿蓬(Suaedaglauca)的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)變化，組裝獲得了平均長度為763 bp的54526個Unigenes。基因差異表達(dá)分析檢測到475個Unigenes表達(dá)下調(diào)，44個上調(diào)。功能分析發(fā)現(xiàn)許多基因與離子轉(zhuǎn)運(yùn)、信號調(diào)節(jié)、細(xì)胞代謝以及干旱和耐鹽響應(yīng)相關(guān)，此次結(jié)果鑒定了許多參與堿蓬耐鹽反應(yīng)的候選基因，也為其他多肉植物研究提供了豐富的參考基因序列。高彩婷等[44]利用Solexa和DGE技術(shù)檢測300 mmol·L-1NaCl處理下VAO-9燕麥(Avenasativa)葉片在0.5、3、8和24 h下的基因表達(dá)情況，并測定了相對電導(dǎo)率、丙二醛和脯氨酸含量變化。結(jié)果獲得了平均長度為645 bp的65810個Unigenes。基因差異表達(dá)分析檢測出0.5 h有306個基因表達(dá)上調(diào)，64個下調(diào)；3 h下639個上調(diào)，290個下調(diào)；8 h下1488個上調(diào)，882個下調(diào)。通路分析發(fā)現(xiàn)差異基因大多富集在激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、磷酸肌醇途徑以及滲透調(diào)節(jié)等途徑。而且脅迫下生理指標(biāo)的變化與相對應(yīng)的Unigenes的表達(dá)變化一致。Ma等[45]利用RNA-Seq技術(shù)分析了旱生植物霸王(Zygophyllumxanthoxylon)在鹽和滲透脅迫下的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況，組裝獲得了平均長度為680 bp的106423個Unigenes。脅迫下檢測到與Na+、K+、Ca2+、Mg2+、氮、磷酸鹽以及微量元素轉(zhuǎn)運(yùn)，離子區(qū)劃及活性氧清除相關(guān)的基因顯著上調(diào)。且相較于滲透脅迫，鹽脅迫下與活性氧清除、光合電子傳遞及碳固定相關(guān)的基因明顯上調(diào)，而葉綠素分解相關(guān)基因表達(dá)減少。這些結(jié)果為以后牧草類以及農(nóng)作物抗逆機(jī)制研究提供了豐富的基因資源。An等[46]利用RNA-seq技術(shù)分析鹽堿脅迫下紫花苜蓿(Medicagosativa)的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)變化，共獲得了53853個Unigenes，處理第1天2286個基因發(fā)生差異表達(dá)，第7天2233個基因差異表達(dá)。大多數(shù)基因與過氧化物酶、光反應(yīng)、類黃酮代謝、脂質(zhì)代謝以及轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)。另外，轉(zhuǎn)錄因子NAC和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因在鹽脅迫表達(dá)下調(diào)，而在鹽堿脅迫下表達(dá)上調(diào)，這為苜蓿耐鹽堿機(jī)制研究提供了新的思路。250 mmol·L-1NaCl處理下，對紅麻(Hibiscuscannabinus)進(jìn)行RNA測序獲得了2384個差異表達(dá)基因(1702個上調(diào))，GO富集發(fā)現(xiàn)抗氧化酶類基因均上調(diào)表達(dá)，大多數(shù)基因與氨基酸代謝以及碳水化合物代謝通路相關(guān)[47](表2)。綜上所述，通過轉(zhuǎn)錄組測序能夠發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子WRKY、抗氧化酶類、蛋白激酶以及與離子轉(zhuǎn)運(yùn)、類黃酮代謝、ABA信號以及碳固定相關(guān)基因在植物應(yīng)對鹽脅迫過程中發(fā)揮重要功能。

表2 部分植物耐鹽分子機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

2.2 干旱脅迫下林草植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

Zhou等[48]利用454測序技術(shù)分析沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)根在PEG處理下的基因表達(dá)差異，組裝獲得了15173個contigs 和13883個singlets，檢測到1827個SSR分子標(biāo)記，功能分析發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個干旱脅迫相關(guān)基因，為以后沙冬青耐旱機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。Yu等[49]利用Solexa測序技術(shù)研究干旱脅迫下(0、1、2和3 d)大白菜(Brassicapekinensis)基因表達(dá)情況，通過測序比對分別有13036、12472、12774和12227個特異性標(biāo)簽比對到數(shù)據(jù)庫，基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)脅迫下總共有1092個基因發(fā)生顯著差異表達(dá)，包括37個轉(zhuǎn)錄因子基因、61個滲透響應(yīng)基因和28個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因。Chen等[50]利用RNA-seq技術(shù)研究干旱處理下2個棉花(Gossypiumhirsutum)品種(耐旱型和干旱敏感型)的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)有13.38%～18.75%的Unigenes發(fā)生差異表達(dá)，且隨著處理時間的延長，差異表達(dá)基因數(shù)目增多。基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)干旱處理下耐旱型棉花的一些包括光合作用在內(nèi)的細(xì)胞代謝過程被抑制。兩種棉花品種中與ABA信號、乙烯信號以及茉莉酸信號通路相關(guān)的基因表達(dá)水平存在顯著差異，說明這些信號通路可能參與棉花抗旱反應(yīng)。Shi等[51]利用Solexa技術(shù)分析干旱脅迫下C3旱生灌木紅砂(Reaumuriasongarica)的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)變化并鑒定其相應(yīng)的耐旱基因，組裝獲得了平均長度為677 bp的77647個Unigenes，其中43054個能比對到已知蛋白，差異基因分析檢測到123個抗旱相關(guān)的候選基因，C4植物光合作用相關(guān)基因在紅砂中也有所表達(dá)，這為旱生植物基因功能分類以及荒漠植物適應(yīng)干旱環(huán)境的遺傳基礎(chǔ)研究提供了豐富的基因資源。Long等[52]利用Solexa技術(shù)分析干旱處理下梭梭(Haloxylonammodendron)轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)情況，組裝獲得了平均長度為728 bp的79918個Unigenes，25619個在Nr數(shù)據(jù)庫獲得注釋?；虮磉_(dá)分析發(fā)現(xiàn)干旱處理下356個基因上調(diào)表達(dá)，704個下調(diào)表達(dá)。通路分析發(fā)現(xiàn)部分差異表達(dá)基因與脂肪酸、淀粉和氮代謝相關(guān)，這些代謝途徑可能參與梭梭干旱響應(yīng)過程；并檢測到了35個干旱誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，包括WRKY、MYB和bZIP家族成員，這為逆境下荒漠植物基因和基因組研究提供了豐富的基因基礎(chǔ)。Steven等[53]利用RNA-seq技術(shù)研究干旱下兩種紅三葉草(Trifoliumpratense)的干旱響應(yīng)機(jī)制，組裝獲得了45181個contigs，鑒定了3127個SSR位點(diǎn)，在7178個contigs中檢測到27922個稀有等位基因SNP。而且正常條件下許多衰老相關(guān)基因都在敏感型紅三葉草中高豐度表達(dá)，干旱處理下干旱敏感型紅三葉草中差異表達(dá)基因數(shù)目大約是耐旱型紅三葉草的2倍，這為紅三葉草的耐旱機(jī)制研究奠定了豐富的基因基礎(chǔ)。Xiao等[54]分析了不同脫水情況下牛耳草(Boeahygrometrica)的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)1239 個基因特異性響應(yīng)中度脫水，4135個基因特異性的響應(yīng)重度脫水；且與植物-病原互作和激素相關(guān)的基因在不同脫水情況下均差異表達(dá)，而與mRNA檢測通路，尤其是光合作用和氮代謝相關(guān)基因只在重度脫水下差異表達(dá)，其中ABA代謝和信號、磷脂信號、胚胎發(fā)育晚期蛋白、過氧化物酶以及早期光誘導(dǎo)蛋白基因大多數(shù)都上調(diào)表達(dá)，這為牛耳草耐旱機(jī)制研究提供了豐富的理論依據(jù)。Zhu等[55]對PEG處理下的一年生禾本科牧草蘇丹草(Sorghumsudanense)進(jìn)行了基因表達(dá)分析，在短期的PEG處理下(3 d)，獲得了2329個差異表達(dá)基因，大多與碳固定和激素信號通路相關(guān)。在長期的PEG處理下(6 d)，獲得了5101個差異表達(dá)基因，大多與激素信號通路相關(guān)，還檢測到17548個SSR。本課題組利用RNA-seq對-0.75 MPa 滲透脅迫處理下的梭梭干旱響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了分析，在梭梭地上部和地下部分別產(chǎn)生了平均長度為556 和535 bp的82736 和99624個 Unigenes；種類分布發(fā)現(xiàn)，梭梭與葡萄同源性最高，同時鑒定到了13486個 SSRs；GO功能分類發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因與細(xì)胞代謝及催化活性相關(guān)；COG分類發(fā)現(xiàn)多數(shù)基因與轉(zhuǎn)錄、翻譯以及核糖體結(jié)構(gòu)相關(guān)；KEGG分類發(fā)現(xiàn)多數(shù)基因與翻譯及碳水化合物相關(guān)。DGE分析發(fā)現(xiàn)，與對照相比，滲透脅迫下地上部分總共有3353個差異表達(dá)基因，其中627個基因在6和24 h下均差異表達(dá)；地下部分總共有4564個差異表達(dá)基因，其中821基因在6和24 h下均差異表達(dá)。地上部與光合、寡糖、有機(jī)酸、胺、異戊二烯以及質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因下調(diào)表達(dá)，而與脅迫、水分匱缺以及茉莉酸刺激響應(yīng)、水楊酸代謝以及類黃酮和乙烯合成相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)；地下部分與分生組織生長、色素積累調(diào)節(jié)以及根系發(fā)育相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)，與水楊酸信號通路、植物螯合肽代謝、激素刺激、氧化和高滲透脅迫響應(yīng)相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)。本研究又進(jìn)行了干旱響應(yīng)基因篩選，發(fā)現(xiàn)與離子轉(zhuǎn)運(yùn)、活性氧清除、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)維持、木質(zhì)素、有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物以及激素合成相關(guān)的大多數(shù)基因均上調(diào)表達(dá)，還有一些常見的水通道蛋白、胚胎發(fā)育晚期蛋白(包括脫水素和脫落酸脅迫成熟誘導(dǎo)蛋白)以及熱激蛋白基因都上調(diào)表達(dá)，這為梭梭耐旱機(jī)制研究提供了豐富的分子基礎(chǔ)，也為植物抗旱分子機(jī)制研究以及優(yōu)良牧草和作物培育提供了大量的候選基因[56](表3)。綜上所述，通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子(WRKY、MYB和bZIP)、水通道蛋白、胚胎發(fā)育晚期蛋白、熱激蛋白、激素信號(ABA、乙烯以及茉莉酸信號)以及活性氧清除相關(guān)基因在植物應(yīng)對干旱脅迫過程中發(fā)揮重要功能。

2.3 低溫及高溫脅迫下林草植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

Zhao等[57]利用Solexa測序技術(shù)對生長于阿爾卑斯山具有極強(qiáng)耐冷性的高山離子芥(Chorisporabungeana)進(jìn)行了低溫處理下的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析，并與擬南芥進(jìn)行比較。結(jié)果獲得了平均長度為888 bp的54870個Unigenes，基因表達(dá)分析檢測到3484個基因表達(dá)上調(diào)，4571個表達(dá)下調(diào)。還發(fā)現(xiàn)了一個與離子芥和擬南芥耐寒相關(guān)的生長調(diào)節(jié)因子Karrikins。功能富集分析發(fā)現(xiàn)與低溫適應(yīng)相關(guān)的基因在擬南芥中上調(diào)表達(dá)，包括轉(zhuǎn)錄因子CBF2和CBF3，而在高山離子芥中沒有CBF同源基因的差異表達(dá)，說明低溫適應(yīng)不是離子芥主要的耐冷方式；但是與蛋白磷酸化和自動泛素化作用相關(guān)的基因在高山離子芥中高豐度表達(dá)，使它能夠快速，靈活的適應(yīng)寒冷環(huán)境，這也導(dǎo)致了擬南芥和離子芥耐寒機(jī)制的不同，這些結(jié)果為植物耐低溫關(guān)鍵基因挖掘提供了重要的理論依據(jù)。Tian等[58]利用Solexa測序技術(shù)研究低溫誘導(dǎo)下火鶴花(Anthuriumscherzerianum)轉(zhuǎn)錄組差異基因表達(dá)情況，組裝獲得了平均長度為560 bp的44382個Unigenes，其中27396個能比對到已知蛋白?？偣矙z測到了4363個差異表達(dá)基因，1、5和 24 h下分別有292、805和708個基因上調(diào)表達(dá)。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)1 h下差異表達(dá)基因主要富集在光合、代謝以及氧化磷酸化途徑；5 h下主要富集在氧化磷酸化途徑；24 h下主要富集在mRNA檢測、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)以及植物病原互作途徑。還發(fā)現(xiàn)了39個低溫誘導(dǎo)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子包括AP2/ERF、Zinc finger protein、NAC、MYB和bZIP 家族成員，這些為火鶴花基因和基因組研究提供了豐富的基因資源。Xin等[59]利用RNA-seq技術(shù)研究耐寒型長白山葡萄(Vitisvinifera)的抗寒響應(yīng)機(jī)制，并與歐洲葡萄進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)在低溫處理下，長白山葡萄差異表達(dá)基因數(shù)(1314)少于歐洲葡萄(2307)，有408個基因在二者中均差異表達(dá)，在葡萄抗寒反應(yīng)中起基礎(chǔ)防御作用。功能分類表明長白山葡萄含有較多的與代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的上調(diào)基因，這些基因可能在葡萄抗寒反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Wang等[60]利用Solexa測序和DGE技術(shù)研究低溫下茶樹(Camelliasinensis)的基因表達(dá)變化，并分析其響應(yīng)方式。結(jié)果獲得了平均長度為356 bp的216831個Unigenes，1770個基因發(fā)生了差異表達(dá)(1168個上調(diào))，大多與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、低溫響應(yīng)、質(zhì)膜穩(wěn)定性以及滲透響應(yīng)等相關(guān)。通路分析表明碳水化合物代謝和鈣信號通路可能在茶樹低溫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。Sperotto等[61]對處于營養(yǎng)生長期的兩種基因型水稻進(jìn)行了低溫(10 ℃)誘導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄組分析，在耐低溫和低溫敏感型水稻中分別獲得了831和357個差異表達(dá)基因，并發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞壁組成相關(guān)的基因在耐低溫植株中大量表達(dá)，使低溫下植株中有較高的纖維素積累；與脂類代謝相關(guān)的基因也在耐低溫植株中大量表達(dá)，使其積累了較多的亞油酸。且相比于敏感型，耐低溫植株具有較高的光合效率和抗氧化能力，以及更有效的乙烯、Ca2+信號通路。Chen等[62]對高溫處理下的二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)幼苗葉片，以及抽穗期的葉片和花序進(jìn)行了RNA-seq分析，656個基因在3組樣品中均發(fā)生了差異表達(dá)，差異基因大多與光合天線蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及剪接體相關(guān)；還發(fā)現(xiàn)1973個可變剪接。綜上所述，通過轉(zhuǎn)錄組測序能夠發(fā)現(xiàn)生長調(diào)節(jié)因子Karrikins、轉(zhuǎn)錄因子(CBF2、AP2/ERF、NAC、MYB、bZIP和CBF3)、亞油酸、纖維素、Ca2+和乙烯信號通路以及細(xì)胞壁組成相關(guān)基因在植物應(yīng)對低溫脅迫過程中發(fā)揮重要功能。

表3 部分植物耐旱分子機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

2.4 養(yǎng)分脅迫下林草植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

排根的形成對于植物適應(yīng)磷饑餓具有重要作用，羽扇豆(Lupinusmicranthus)因?yàn)橛邪l(fā)育良好的排根，能夠在低磷條件下正常生長。O’Rourke等[63]利用RNA-seq技術(shù)分析缺磷狀態(tài)下羽扇豆葉片、根以及排根的基因表達(dá)及其適應(yīng)機(jī)理。通過測序組裝獲得了平均長度為1155 bp的125821個Unigenes，其中50734個基因具有轉(zhuǎn)錄活性?；虮磉_(dá)分析總共檢測到2128個差異表達(dá)基因，葉片中有1342個(987個在磷充足葉片上調(diào))，根中有904個(396個在磷充足根中上調(diào))，包括110個磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和155個轉(zhuǎn)錄因子，有12個基因在擬南芥和馬鈴薯中也存在差異表達(dá)。之后，Secco等[64]利用Solexa測序技術(shù)研究磷饑餓下羽扇豆排根的發(fā)育和調(diào)控機(jī)理，通過測序組裝，產(chǎn)生了46383個contigs，再并入到已公布的羽扇豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，最后形成高質(zhì)量的65097個contigs。通過功能注釋，磷饑餓下在排根發(fā)育的不同階段發(fā)現(xiàn)許多差異表達(dá)基因，成熟的排根中有許多與膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和代謝適應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)，根尖中只有直接參與磷吸收與平衡的基因有表達(dá)，而與分生組織活性和發(fā)育進(jìn)程相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子以及細(xì)胞分裂素和生長素基因在排根尖中有較高表達(dá)，說明轉(zhuǎn)錄因子和激素在排根發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，而且不同生長階段的排根在耐磷饑餓過程中功能不盡相同。邵彩虹等[65]利用RNA-seq技術(shù)對水稻根系響應(yīng)氮素脅迫的分子機(jī)制進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)脅迫下，根系有2270個基因發(fā)生了差異表達(dá)，其中木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶肉桂酰輔酶A還原酶基因、參與細(xì)胞伸長發(fā)育的EGase基因以及與生長素和新RNA合成相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)，以促進(jìn)根系伸長生長來應(yīng)對養(yǎng)分脅迫刺激。

通過RNA測序，可以分析植物在高鹽、干旱、低溫、高溫及營養(yǎng)匱缺等非生物脅迫下的基因表達(dá)及信號通路變化，從而篩選出一些脅迫響應(yīng)基因；也可以通過比較兩個不同抗性品種在非生物脅迫前后的基因表達(dá)差異，直接鑒定出抗逆關(guān)鍵基因，探究植物適應(yīng)機(jī)理，對關(guān)鍵基因分子功能進(jìn)行更深一步的研究，并應(yīng)用于牧草及作物的抗逆遺傳改良。

3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)與其他功能基因組學(xué)相結(jié)合研究

RNA-seq與DNA測序相結(jié)合可以檢測SNP、RNA編輯以及表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)，尤其在分析中將基因型數(shù)據(jù)和基因表達(dá)變化進(jìn)行相關(guān)分析可以獲得復(fù)雜性狀的遺傳機(jī)理，例如植株高度，且表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)遺傳變異能夠影響許多基因的表達(dá)[66-67]。RNA-seq與重測序結(jié)合可以在融合基因分析中去除假陽性，還能分析拷貝數(shù)的改變[68-69]。通過將RNA-seq與DNA甲基化進(jìn)行整合，對差異表達(dá)基因和甲基化模式進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，能夠識別具有差異表達(dá)和差異甲基化的一個或多個基因[70]。RNA-seq與轉(zhuǎn)錄因子染色質(zhì)免疫共沉淀測序(chromatin immunoprecipitation, ChIP)結(jié)合分析可以去除ChIP-seq中的假陽性，并能檢測出轉(zhuǎn)錄因子對其目標(biāo)基因的激活或抑制效應(yīng)。RNA-seq與miRNA-seq整合分析能夠闡明miRNAs對轉(zhuǎn)錄穩(wěn)態(tài)水平的調(diào)節(jié)效應(yīng)。RNA-seq與蛋白質(zhì)組學(xué)分析相關(guān)性不高，但二者整合分析能夠鑒定新的亞型，RNA-seq結(jié)果中沒有檢測到某個基因的表達(dá)，但在質(zhì)譜分析中發(fā)現(xiàn)它的多肽，說明發(fā)生了翻譯后修飾。RNA-seq與代謝組學(xué)相結(jié)合能夠鑒定出在基因表達(dá)和代謝水平均發(fā)生了變化的信號通路。另外，還能通過一些軟件或在線網(wǎng)站將多個基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析。SNMNMF和PIMiM能夠?qū)RNA和 miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)與蛋白-蛋白、DNA-蛋白、miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)合起來鑒定miRNA-基因調(diào)控模式[71-72]。MONA能夠?qū)⒉煌降墓δ芑蚪M學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合起來，包括mRNA、miRNA、DNA甲基化和蛋白質(zhì)組學(xué)，以檢測樣品生物學(xué)功能的改變[73]。Paintomics可以整合任何類型的基因組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行通路分析[74]。3Omics可以對轉(zhuǎn)錄組、代謝組和蛋白質(zhì)組進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，研究其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[75]。目前需要做的就是要把轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與其他組學(xué)相結(jié)合，從多方面更系統(tǒng)、更深入地對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得更充分、更精確的研究結(jié)果。

4 展望

新一代高通量測序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于林草植物抗逆性研究中，并且取得了較好的成果。但是RNA-seq數(shù)據(jù)結(jié)果容易受參數(shù)設(shè)置影響，尤其是低豐度表達(dá)基因。相信隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，即測序時間和成本的不斷壓縮，以及測序通量和準(zhǔn)確度的不斷提高，用少量的mRNA就能構(gòu)建cDNA文庫用于測序，并獲得較長的reads，得到優(yōu)質(zhì)的且精確度較高的轉(zhuǎn)錄本；在接下來的幾年中，RNA-seq分析會越來越完善，也必定會帶來更加驚人的發(fā)現(xiàn)。此外，以單分子測序儀，單分子實(shí)時測序(single molecule real time，SMRT)以及即時DNA測序技術(shù)為主的第三代測序技術(shù)，即單分子測序逐漸呈現(xiàn)，它不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可直接對DNA分子全長進(jìn)行單獨(dú)測序。但是三代測序技術(shù)剛起步，還不夠完善、成熟，每次對單個細(xì)胞只能進(jìn)行一種功能基因組的檢測，不能在檢測轉(zhuǎn)錄組的同時進(jìn)行其他組學(xué)分析，且堿基錯誤率較高，費(fèi)用昂貴，未能得到大面積使用。今后的發(fā)展趨勢是要不斷改進(jìn)并創(chuàng)造性的綜合利用各種測序技術(shù)，將RNA-seq與三代測序技術(shù)相結(jié)合來進(jìn)行糾錯，降低錯誤率，獲得豐富且精確的轉(zhuǎn)錄本。還要將轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白組學(xué)以及代謝組學(xué)等其他組學(xué)相關(guān)聯(lián)，進(jìn)行整合分析，更好地應(yīng)用于植物抗逆關(guān)鍵基因的鑒定及抗逆分子機(jī)理研究。