溫室條件下AM真菌和禾草內(nèi)生真菌對根腐離蠕孢侵染黑麥草的影響

鄧杰，李芳，段廷玉

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

多年生黑麥草(Loliumperenne)原產(chǎn)于西歐、北非和西南亞等地，廣泛分布于世界各地的溫帶地區(qū)[1]。它是黑麥草屬中培育最早且應(yīng)用最廣泛的品種之一，也是新西蘭、歐洲、澳大利亞等地的優(yōu)良草種[2]，更是我國草地畜牧業(yè)生產(chǎn)和草坪綠地建植的主要草種之一。具有種子活力高，易建植；生長周期長，養(yǎng)分利用率高；適口性和質(zhì)量好，產(chǎn)量高，再生能力強，耐踐踏[1,3]的特點。

真菌病害是限制黑麥草生產(chǎn)與利用的主要限制因素之一。有的真菌病害會造成毀滅性的危害，如腐霉病(Pythiumspp.)能在一夜之間毀滅一片剪股穎(Agrostisstolonifera)草坪[4]。此外，病原菌能降低植物產(chǎn)量，改變植被組成[5]，一些病原菌侵染植物后產(chǎn)生有毒物質(zhì)導(dǎo)致家畜中毒，給畜牧業(yè)的發(fā)展造成重大經(jīng)濟損失。僅中國國內(nèi)就發(fā)現(xiàn)了14屬24種真菌能引起黑麥草病害。如銹病[6]、褐斑病和腐霉枯萎病[7]、黑斑病和葉斑病[8]等。作為重要的牧草和草坪草，黑麥草在生產(chǎn)和利用過程中對腐霉枯萎病、立枯病、銹病、褐斑病、紅線病以及葉斑病[9-10]等諸多病害較為敏感。其中，由根腐離蠕孢(Bipolarissorokinianum)引起的葉斑病是危害較大的一種真菌病害之一。離蠕孢葉斑病在牧草葉片上形成灰色至褐色的梭形病斑，該病害可導(dǎo)致黑麥草的胚芽和根基部腐爛、幼苗枯萎和猝倒等[8,11]。

微生物與植物經(jīng)過長期的協(xié)同進化，形成了共生、共棲和寄生等多種復(fù)雜關(guān)系。叢枝菌根(arbuscular mycorrhizal，AM)真菌和禾草內(nèi)生真菌是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的重要微生物成員，積極利用微生物手段防治病害是經(jīng)濟且有效的措施[12]。禾草內(nèi)生真菌是指在禾草中度過全部或大部分生命周期，而禾草不顯示外部癥狀的一大類真菌，如Epichlo?屬[13]，禾草-內(nèi)生真菌共生體是自然界中較為常見的一種共生體類型。全世界已發(fā)現(xiàn)43種、我國已報道7種Epichlo?內(nèi)生真菌[14-15]。在長期演化過程中，內(nèi)生真菌與寄主植物之間形成互惠共生的關(guān)系：寄主植物能為內(nèi)生真菌的生存提供“住所”和營養(yǎng)物質(zhì)[16-17]，反過來內(nèi)生真菌產(chǎn)生的代謝物又可以影響宿主植物的生長和發(fā)育[18]，并促進養(yǎng)分、水分的吸收[19-20]，從而提高寄主植物對干旱等非生物逆境和病蟲等生物脅迫的抵抗能力[21-24]。

叢枝菌根真菌屬于球囊菌門(Glomeromycota)、球囊菌綱(Glomeromycetes)，可與約80%植物根系形成菌根共生體[25]。迄今為止，我國發(fā)現(xiàn)并報道的AM真菌有147個種，約占全世界已報道的AM真菌種數(shù)的1/2[26]。AM真菌能通過根外菌絲在土壤與宿主植物之間進行離子交換，從而減少土壤侵蝕，維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定[27]。此外，AM真菌與土壤根際微生物之間能形成菌根根圈效應(yīng)，能拓展根系的吸收面積，從而增加宿主植物對礦質(zhì)養(yǎng)分和水分的吸收[28]，并增加植物體內(nèi)激素的合成，使植物體內(nèi)光合產(chǎn)物重新分布，提高植物在逆境條件下的耐受性[29]。

本研究在根部和葉片對黑麥草接種根腐離蠕孢，探究禾草內(nèi)生真菌和AM真菌與病原菌互作中，黑麥草的生長、光合速率、P吸收以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)濃度和酶活性的變化，以期為利用AM真菌和禾草內(nèi)生真菌防治植物病害，提高和維持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力和可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物為多年生黑麥草“球道”品種。帶有禾草內(nèi)生真菌(E+)和不帶禾草內(nèi)生真菌(E-)的黑麥草種子分別收集于以前研究的E+和E-植物。挑選大小一致且籽粒飽滿的黑麥草種子，先用75%的酒精消毒3 min，再用3%的次氯酸鈉對種子進行表面消毒10 min，用蒸餾水先沖洗3次后，擺放在有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗催芽24 h。

供試AM真菌菌劑：根內(nèi)球囊霉(Rhizophagusintraradices)購買于北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所,以三葉草(Trifoliumrepens)為宿主進行擴繁，擴繁所得的孢子、培養(yǎng)基質(zhì)以及植物根段混合物作為本試驗的接種物。

本試驗所用病原菌為根腐離蠕孢，由田間黑麥草病株分離所得。將發(fā)病葉片分別用75%酒精和1%次氯酸鈉表面消毒，并用無菌水沖洗3～4次后，用滅菌濾紙吸干葉片表面的水分。將葉片切成約0.2 cm的小塊后，放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基上，25 ℃條件下生長4 d后純化目標(biāo)病原菌，并通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和科赫法則鑒定和驗證。病原菌純化培養(yǎng)4周后，在培養(yǎng)病原菌的培養(yǎng)皿中注入10 mL滅菌水，用載玻片刮下培養(yǎng)基表面上的孢子和菌絲，并用紗布過濾后，將所有病原菌孢子收集到滅菌容器中，充分分散后配成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計數(shù)，孢子濃度大約106個·mL-1。

供試土壤購于蘭州花市，黑壤土，土壤過2 mm篩后，與河沙按1∶1充分混合，于121 ℃高壓滅菌兩次，每次滅菌1 h，間隔24 h?；旌匣|(zhì)pH=5.85，速效P含量為19.17 mg·kg-1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2015年5-8月在蘭州大學(xué)榆中校區(qū)智能溫室進行。試驗處理包括2個禾草內(nèi)生真菌處理、2個AM真菌處理和3個病原菌處理組合，分別為侵染禾草內(nèi)生真菌(E+)和未侵染禾草內(nèi)生真菌(E-)，接種根內(nèi)球囊霉(AM)和不接根內(nèi)球囊霉(NM)，并在上述處理下植物根部(B+根)、葉片(B+葉)分別接種根腐離蠕孢及不接種病原菌(B-)，以NME-B-為試驗對照，共12個處理，每個處理4個重復(fù)，共48盆。

生長條件：試驗期間，溫室溫度保持在23～28 ℃ (白天)和 20～25 ℃(夜晚)，濕度保持在65%～90%，自然光照，每天光照時長約為15 h。48盆黑麥草在溫室隨機擺放，隔天隨機調(diào)換花盆位置，以盡量減少外界因素干擾。

接種方法：首先建立AM真菌處理，包括：1)接種AM真菌處理(AM);2)不接種AM真菌的對照(NM)。接種物含有真菌孢子、菌絲、侵染根段等繁殖體及混合基質(zhì)。接種處理每盆加入30 g根內(nèi)球囊霉菌劑，不接種處理每盆加30 g滅菌AM真菌菌劑。將經(jīng)過催芽的E+，E-種子分別移栽至上述AM真菌處理土壤中，生長2周后，用Florea等[30]的方法檢測黑麥草葉鞘中內(nèi)生真菌菌絲，并保留生長較為一致的3棵植株繼續(xù)生長，建立NME+、NME-、AME+和AME-處理。植株在溫室生長6周后，在上述各處理中接種根腐離蠕孢。根腐離蠕孢按不同方式接種，包括：1)葉部噴霧法接種(B+葉);2)根部灌根法接種(B+根)，每盆接種10 mL 孢子懸浮液；3)不接種病原菌(B-)處理以葉部噴霧法接種10 mL蒸餾水作為對照。將各處理的黑麥草用黑色塑料袋保濕24 h。2周后測定發(fā)病率、光合速率并收獲，收獲后測定菌根侵染率、P吸收，生物量及生理生化指標(biāo)。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1黑麥草發(fā)病率 葉部和根部接病的植株發(fā)病率都是以植株葉片是否出現(xiàn)病斑的標(biāo)準來進行統(tǒng)計的，發(fā)病植株的葉片早期出現(xiàn)退綠斑，斑點周圍有一定程度的黃化，斑點逐步擴大，后期病部黃化枯死，發(fā)病嚴重的植株幾乎遍布整個葉片。統(tǒng)計時以葉片出現(xiàn)斑點，無論斑點大小、多少均記為發(fā)病。

發(fā)病率：每盆隨機取25個葉片，統(tǒng)計發(fā)病的葉片數(shù)，每盆發(fā)病率=發(fā)病葉片數(shù)/25×100%。每個處理的發(fā)病率為4個重復(fù)的平均值。

1.3.2AM真菌侵染率 染色鏡檢法測定菌根侵染率。取0.2 g左右沖洗干凈的黑麥草根系，裝入15 mL離心管，倒入10 mL 10%的KOH溶液浸泡植物根系。在60 ℃水浴鍋中水浴60 min左右，觀察根系表皮顏色是否已消除。如顏色已去除，則將去色的根系在1 mol·L-1的HCl中浸泡10 s左右，然后用蒸餾水沖洗3次，再裝入原離心管。在各處理好的離心管中加入10 mL 0.05% Trypan-Blue染色[31]，在60 ℃水浴鍋中保持5～10 min，倒出染色劑后加入固定液(乳酸∶甘油：水=1∶1∶1)保存，用“十字交叉法”測定各處理盆的菌根侵染率[32]。

1.3.3凈光合速率的測定 收獲前，選擇天氣晴朗的上午9:00-11:00，于普通空氣條件下用Li-6400便攜式光合儀測定葉片的凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn，μmol·m-2·s-1)和氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance，Gs，μmol·m-2·s-1),從每盆植株中隨機選一株植物，并選取該株植物新分蘗葉附近的葉片來測定，每隔15 s計1個值，每盆共計錄5個值，每個處理測4盆，然后計算平均值。

1.3.4總生物量測定 齊地面剪下地上部分，每個處理剪4盆，每盆剪3株植物，每盆中的植物總量作為一個重復(fù)，每個處理計4個重復(fù)，每個處理將植株地上部分和根部均先稱取鮮重后，在105 ℃殺青20 min，然后于80 ℃烘箱烘至恒重?？偵锪?地上部分干重+根部干重。

1.3.5總P含量測定 將烘干的植物地上部分和根部樣品研磨后，分別稱取0.2 g于100 mL消化管中，每管加 3 g K2SO4和0.3 g CuSO4催化劑，并加10 mL H2SO4，于420 ℃消煮2 h。消化好的溶液定容至100 mL。采用鉬銻抗吸光光度法，建立標(biāo)準曲線，用分光光度計(Pectrum, Shanghai 721,中國)，于390 nm處測定吸光度值[33]。每盆植株總P含量=地上P含量+根P含量。

1.3.6生理生化指標(biāo)的測定 采集接種病原菌植株的發(fā)病葉片(若接病后沒發(fā)病，則采集與發(fā)病植株所采集的相同部位的葉片)和未接種病原菌植株的相同部位的健康葉片測定生理生化指標(biāo)。植株的葉綠素含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性和MDA濃度分別參照王學(xué)奎[34]的丙酮浸提法、氮藍四唑法和硫代巴比妥酸法測定。H2O2含量參照Velikova等[35]的分光光度計比色法測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2007進行數(shù)據(jù)的整理、計算和作圖。用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對微生物間的互作關(guān)系進行三因素方差分析。分析過程中首先對數(shù)據(jù)進行Levenes方差齊性檢驗，若方差齊性(P>0.05)，則可進一步分析。用Tukey’s HSD法(Tukey’s honestly significant difference)檢測各處理間的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 AM真菌、禾草內(nèi)生真菌及病原菌互作對黑麥草的影響

病原菌、AM真菌和禾草內(nèi)生真菌，以及病原菌和禾草內(nèi)生真菌互作均可顯著影響黑麥草的菌根侵染率、葉綠素含量、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、總P含量、總生物量、MDA濃度、H2O2濃度和SOD活性；病原菌和AM真菌互作對黑麥草葉綠素含量無顯著影響，但顯著影響其余所有指標(biāo)；AM真菌和禾草內(nèi)生真菌互作顯著影響黑麥草發(fā)病率、菌根侵染率、總P含量、MDA濃度、H2O2濃度和SOD活性；病原菌、AM真菌和禾草內(nèi)生真菌互作顯著影響黑麥草發(fā)病率、菌根侵染率、凈光合速率、總P含量、MDA濃度、H2O2濃度和SOD活性(表1)。AM真菌、禾草內(nèi)生真菌和病原菌之間互作對黑麥草發(fā)病率和菌根侵染率有顯著交互作用(表1)。

2.2 黑麥草發(fā)病率和菌根侵染率

未接種病原菌的黑麥草葉片未出現(xiàn)病斑，葉部接種病原菌處理下，NME-、NME+、AME-和AME+處理下的黑麥草葉片發(fā)病率分別為31.25%、21.25%、3.37%和2.50%，與NME-對照相比，侵染禾草內(nèi)生真菌和接種AM真菌的處理均一定程度地降低了黑麥草發(fā)病率，降幅為32.00%～92.00%。根部接種病原菌條件下，NME-和NME+處理下的黑麥草發(fā)病率分別為22.50%和18.75%，AME-和AME+處理下的黑麥草未發(fā)病(圖1a)。

未接種AM真菌的處理，黑麥草根系未檢測到菌根結(jié)構(gòu)。接種AM真菌的處理，黑麥草根系均不同程度地受到侵染，侵染率為16.18%～31.24%。未接種和根部接種病原菌處理下，與E-植株相比，E+植株的菌根侵染率分別降低24.37%和48.21%(P<0.05)。葉部接種病原菌處理下，與E-植株相比，E+植株雖降低黑麥草根系菌根侵染率，但差異不顯著(P>0.05)。與B-處理相比，不管是否侵染禾草內(nèi)生真菌，葉部接種病原菌均顯著降低了黑麥草根系菌根侵染率，降幅分別為30.42%和33.83%(P<0.05)，而根部接種病原菌的黑麥草，僅E+植株根系的菌根侵染率顯著降低31.49%(P<0.05，圖1b)。

表1 3種微生物及其相互作用的方差分析

注：B×M：病原菌與AM真菌的交互作用；B×E：病原菌與禾草內(nèi)生真菌的交互作用；M×E：AM真菌與禾草內(nèi)生真菌的交互作用；B×M×E：病原菌、AM真菌和禾草內(nèi)生真菌三者間的交互作用；NS表示經(jīng)Tukey’s HSD法檢驗在P<0.05水平差異不顯著。

Note： B×M means interaction betweenB.sorokinianaand arbuscular mycorrhizal；B×E means interaction betweenB.sorokinianaand grass endophyte；M×E means interaction between arbuscular mycorrhizal and grass endophyte；B×M×E means interaction amongB.sorokiniana, arbuscular mycorrhizal and grass endophyte；NS indicate there is not significant difference atP<0.05 level by Tukey’s HSD test.

2.3 不同接病處理下黑麥草葉綠素含量和光合指標(biāo)

與未接種病原菌的處理相比，葉部接種病原菌顯著降低了NME-、NME+、AME-和AME+各處理下黑麥草的氣孔導(dǎo)度和葉綠素含量，降幅為10.63%～14.55%和28.95%～59.16%(P<0.05，圖2b,c)。同時，葉部接種病原菌顯著降低了NME-、AME-和AME+各處理下黑麥草的凈光合速率，降幅為33.02%～57.86%(P<0.05，圖2a)；根部接種病原菌顯著降低了NME-處理下黑麥草的凈光合速率和AME-處理下黑麥草的氣孔導(dǎo)度。葉片和根部接病處理下，與NME-對照相比，AM真菌和禾草內(nèi)生真菌均能提高黑麥草凈光合速率和葉綠素含量(圖2a,c)，二者共同作用時(AME+)，顯著提高黑麥草葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和葉綠素含量，增幅為132.25%和132.17%、56.00%和134.48%、37.69%和40.77%(P<0.05，圖2a～c)。

圖1 不同接病處理下黑麥草發(fā)病率和菌根侵染率

2.4 不同接病處理下黑麥草總P含量

圖2 不同接病處理下黑麥草凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和葉綠素含量

與未接種病原菌的處理相比，葉部接種病原菌顯著降低了NME-、AME-和AME+各處理下黑麥草總P含量，降幅為12.61%～35.06%(P<0.05)；根部接種病原菌僅顯著降低了AME+處理下黑麥草的總P含量(P<0.05)。葉片接病處理下，與NME-對照相比，AM真菌和禾草內(nèi)生真菌單獨或同時存在均能顯著提高黑麥草總P含量，增幅分別為38.27%、37.75%和41.51%(P<0.05)。根部接病處理下，與NME-對照相比，僅AM真菌和禾草內(nèi)生真菌同時存在時顯著提高黑麥草總P含量38.17%(P<0.05，圖3)。

2.5 不同接病處理下黑麥草總生物量

與未接種病原菌的處理相比，葉部接種病原菌顯著降低了NME+和AME+處理下黑麥草總生物量，降幅分別為13.48%和20.63%(P<0.05)；根部接種病原菌顯著降低NME+處理下黑麥草的總生物量12.13%(P<0.05)。葉片接病處理下，與NME-對照相比，AM真菌和禾草內(nèi)生真菌單獨或同時存在均未顯著提高黑麥草總生物量(P>0.05)。根部接病處理下，與NME-相比，接種AM真菌顯著提高了黑麥草總生物量，增幅為14.88%和32.72%(P<0.05，圖4)。

2.6 不同接病處理下黑麥草黑麥草MDA和H2O2濃度

與未接種病原菌的處理相比，葉部接種病原菌顯著提高了NME-、NME+、AME-和AME+各處理下黑麥草的丙二醛濃度以及NME-和AME-處理下黑麥草的H2O2濃度；根部接種病原菌顯著提高了NME-、NME+、AME-和AME+各處理下黑麥草的丙二醛和H2O2濃度。葉片接病處理下，與NME-對照相比，AM真菌和禾草內(nèi)生真菌單獨或同時存在均顯著降低了黑麥草的丙二醛和H2O2濃度，降幅為21.60%～31.36%和24.14%～58.62%(P<0.05，圖5a, b)。根部接病處理下，AM真菌和禾草內(nèi)生真菌單獨或同時存在均顯著降低了黑麥草的H2O2濃度，降幅為14.82%～22.22%(P<0.05，圖5b)，同時，AM真菌和禾草內(nèi)生真菌共同作用時顯著降低了根部接種病原菌處理下黑麥草的丙二醛濃度24.45%(P<0.05，圖5a, b)。

圖5 不同接病處理下黑麥草MDA和H2O2濃度

2.7 不同接病處理下黑麥草SOD活性

圖6 不同接病處理下黑麥草SOD活性

與未接種病原菌的處理相比，葉部和根部接種病原菌顯著提高了NME+、AME-和AME+各處理下黑麥草的SOD活性。葉片接病處理下，與NME-對照相比，AM真菌和禾草內(nèi)生真菌單獨或同時存在均顯著提高了黑麥草的SOD活性，增幅為52.40%～95.65%(P<0.05)。根部接病處理下，AM真菌和禾草內(nèi)生真菌共同作用時顯著提高了黑麥草的SOD活性11.72%(P<0.05，圖6)。

2.8 AM真菌、禾草內(nèi)生真菌和病原菌互作的相關(guān)性分析

相關(guān)分析結(jié)果顯示，黑麥草的發(fā)病率與菌根侵染率、葉綠素含量、光合指標(biāo)以及P吸收和生物量有顯著負相關(guān)關(guān)系，但與MDA和H2O2濃度呈顯著正相關(guān)關(guān)系。黑麥草根系菌根侵染率與葉綠素含量、光合指標(biāo)、P吸收和生物量有顯著正相關(guān)關(guān)系，與黑麥草發(fā)病率、MDA和H2O2濃度呈顯著負相關(guān)關(guān)系。黑麥草生物量的積累與葉綠素含量、光合指標(biāo)、P吸收以及根系菌根侵染率等有顯著正相關(guān)關(guān)系，并且與黑麥草發(fā)病率、MDA和H2O2濃度呈顯著負相關(guān)關(guān)系(表2)。

表2 AM真菌、禾草內(nèi)生真菌和病原菌互作的相關(guān)性分析

*:P<0.05;**:P<0.01.

3 討論與結(jié)論

病原菌侵染會顯著降低凈光合速率、葉綠素含量以及P吸收，最終導(dǎo)致植物生長減弱，生物量的積累減少[36-38]。本研究結(jié)果表明，根部和葉片接種病原菌均能在一定程度上降低黑麥草的光合速率和P吸收，最終導(dǎo)致生物量減少。這與葉綠素含量、光合速率與P吸收和黑麥草發(fā)病率有顯著負相關(guān)關(guān)系，而與黑麥草生物量有顯著正相關(guān)關(guān)系有關(guān)。低的光合速率通常意味著植物生長緩慢[39]，最終導(dǎo)致產(chǎn)量減少[40]。

本試驗探究了AM真菌和禾草內(nèi)生真菌互作對根部和葉片接種病原菌的黑麥草生長、P吸收、光合速率及丙二醛濃度和SOD活性的影響。結(jié)果表明：接種病原菌，尤其是葉片接種病原菌，顯著降低了黑麥草生長、P吸收、光合速率，增加了MDA濃度。接種AM真菌和侵染禾草內(nèi)生真菌均能在一定程度上促進黑麥草生長，促進P吸收和光合作用的進行，從而降低黑麥草的發(fā)病率和MDA濃度，緩解病害對黑麥草植株造成的傷害。

禾草內(nèi)生真菌能顯著提高白粉病侵染病株的葉綠素含量、凈光合速率和胞間二氧化碳濃度，促進植物生長[37]；此外，番茄(Lycopersiconesculentum)根系接種摩西球囊霉(Glomusmosseae)能顯著提高感染番茄灰霉病植株的總?cè)~綠素含量和凈光合速率[41]。本研究也發(fā)現(xiàn)AM真菌和禾草內(nèi)生真菌均可在一定程度上促進光合作用的進行和P吸收，從而提高生物量的積累。且二者共存時，促進效應(yīng)最好。這說明AM真菌和禾草內(nèi)生真菌均能促進光合作用的進行和P的吸收，促進植物生長，提高植物對病害的抗性，這可能是因為禾草內(nèi)生真菌和AM真菌均可在逆境條件下降低植物體內(nèi)活性氧的積累和膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物的積累[6,42]，本研究結(jié)果顯示禾草內(nèi)生真菌和AM真菌的存在均可降低MDA和H2O2濃度，增加SOD活性，且二者同時存在時，MDA和H2O2濃度最低，SOD活性最高。這跟發(fā)病率與MDA和H2O2濃度呈顯著正相關(guān)，而菌根侵染率與MDA和H2O2濃度呈顯著負相關(guān)關(guān)系以及與SOD活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系有關(guān)。說明病原真菌入侵時，AM真菌和禾草內(nèi)生真菌能在一定程度上提高抗氧化保護酶活性，降低膜質(zhì)過氧化作用，從而緩解病害對植物造成的傷害。且在植物遭遇逆境時，兩種微生物間存在協(xié)同作用。

另外，在本試驗中發(fā)現(xiàn)，AM真菌的侵染率會因禾草內(nèi)生真菌以及病原菌的存在而降低，Zambolim 等[43]發(fā)現(xiàn)侵染殼球孢菌，立枯絲核菌和腐皮鐮刀菌后，大豆根系摩西球囊霉的侵染率降低38%，Liu等[44]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌的侵染降低了黑麥草根系菌根侵染率，并且在高磷水平下，禾草內(nèi)生真菌的存在可顯著抑制叢枝菌根真菌的侵染[45-46]。這可能是因為AM真菌的侵染是一個動態(tài)過程，伴隨著植物的生長而不斷發(fā)生，當(dāng)接種病原菌之后，病原菌與AM真菌在寄主體內(nèi)存在位點競爭或?qū)棺饔肹47-48]，從而相互抑制，此外，病原菌侵染降低了植物的光合速率和葉綠素含量，禾草內(nèi)生真菌的存在減少了光合產(chǎn)物向根部的運輸，減少了AM真菌自身所需要的養(yǎng)分分配，從而降低了AM真菌的侵染率。AM真菌在與病原菌爭奪資源與位點的過程中侵染率雖然有一定程度的降低，但也很大程度上減少了病原菌可利用的資源與空間，從而抑制了病原菌的侵染與繁殖，體現(xiàn)出AM真菌對提高植物抗病性的作用。另外，禾草內(nèi)生真菌的存在只是降低了AM真菌的侵染率，植物根部依然存在AM真菌的侵染，因此不影響AM真菌提高植物抗病性的作用，也同樣不影響二者的協(xié)同作用。

黑麥草的需求和利用逐年增加，因此，防控病害，提高產(chǎn)量是各國亟待解決的問題。雖然化學(xué)殺菌劑可有效防治植物真菌引起的病害，但化學(xué)殺菌劑易污染環(huán)境，且長期使用化學(xué)殺菌劑，易使病原物產(chǎn)生抗藥性，因此，積極采用微生物防治手段是最經(jīng)濟有效的措施。大量研究證實，AM真菌和禾草內(nèi)生真菌能顯著促進植物光合速率、P吸收，增加葉綠素含量和生物量，降低MDA和H2O2濃度，能在一定程度上提高植物的養(yǎng)分吸收和碳水化合物的積累，增強植物對病害的抗性。表明AM真菌和禾草內(nèi)生真菌在多年生黑麥草生產(chǎn)系統(tǒng)中具有廣泛的應(yīng)用前景。