miR-124在腎癌中的表達(dá)以及對(duì)腎癌786-O細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

胡剛強(qiáng) 費(fèi)安華△ 李浩勇 寧金卓

(1.湖北省鄂州市中心醫(yī)院(武漢大學(xué)人民醫(yī)院鄂州醫(yī)院)泌尿外科，湖北 鄂州 436000；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科，湖北 武漢 433000)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)又稱腎癌，是一種起源于腎小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率位居泌尿系統(tǒng)腫瘤的第三位[1-2]。清楚腎癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制以及確定其治療靶點(diǎn)，對(duì)于腎癌的診斷和治療至關(guān)重要[3-4]。MicroRNA(miRNA)是一類高度保守的小RNA 分子，可在轉(zhuǎn)錄后水平結(jié)合基因的3’非翻譯區(qū)(3’untranslatedregion，3’UTR)調(diào)控靶基因表達(dá)，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用[5]。miR-124是近年來發(fā)現(xiàn)的miRNAs家族中的一個(gè)重要分子，miR-124可通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。本實(shí)驗(yàn)旨在研究miR-124在腎癌組織的表達(dá)以及過表達(dá)miR-124后對(duì)腎癌786-O細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，并進(jìn)一步探討miR-124是否通過調(diào)控Zeste同源增強(qiáng)子(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)來實(shí)現(xiàn)其作用。

1 材料與方法

1.1試劑及材料 人腎癌786-O細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清，美國(guó)Gibco公司；Trizol、Lipofectamine2000試劑、MTT檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Invitrogen公司；miR-214 mimics及對(duì)照(miR-214 NC)由上海吉瑪生物技術(shù)公司提供；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒，Takara 生物有限公司；Transwll 小室、Matrigel基質(zhì)膠，美國(guó)Corning公司；EZH2抗體，Abcam公司。

1.2病例標(biāo)本 收集62例2016年1月至2018年6月在我院手術(shù)的患者腎癌病理組織標(biāo)本及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本，其中男27例，女35例，年齡43～76歲，平均59.3歲。術(shù)中組織液氮凍存后放入-80 ℃液氮中存用。本研究中的所有方案均獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)同意并獲得批準(zhǔn)，術(shù)前患者均簽署了知情同意書。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 腎癌 786-O 細(xì)胞在37℃、5% CO2的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，0.25%的胰酶消化傳代。2～3 d換液1次，3～5 d傳代1次。細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至70%～80%，腎癌細(xì)胞采用無血清的培養(yǎng)基同步化24 h，按照Lipofectamine 2000說明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染及后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。

1.4細(xì)胞增殖水平檢測(cè) 采用MTT比色法，將成功轉(zhuǎn)染miR-124的腎癌786-O細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后接種于96孔板中，每孔加入5 g/L二苯基溴化四氮唑藍(lán)(MTT)50 μL。孵育后加入DMSO振蕩10 min，采用自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm讀取光密度值(OD)。

1.5Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移和侵襲能力 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)均使用Corning BioCoatTMMatrigel小室，分為帶膠和不帶膠小室兩種。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的miR-124 mimics和miR-124 NC細(xì)胞，胰酶消化后加入50 μL含 10 g/L牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，調(diào)整細(xì)胞密度至2×106個(gè)/mL，將Transwell小室置入每孔500 μL 10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)約24 h后觀察膜及孔下細(xì)胞數(shù)。將小室放入1%結(jié)晶紫溶液中染色5 min，染色結(jié)束后洗脫殘余結(jié)晶紫溶液，用棉簽擦去基質(zhì)膠和小室內(nèi)的細(xì)胞并拍照計(jì)數(shù)。

1.6Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EZH2蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞蛋白，加入含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液，混勻后置于冰上(4 ℃)裂解30 min，采用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。PVDF膜轉(zhuǎn)膜后用含5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入EZH2抗體，放置于4 ℃孵育過夜。采用羊抗鼠的二抗(1∶5 000)孵育2 h，TBST液洗滌3次，10 min/次，在暗室中滴加 ECL發(fā)光液曝光顯影。

1.7逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)miR-124的表達(dá)水平 采用Trizol法提取組織中總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。以cDNA 為模板，用SYBR Green做熒光染料，RT-PCR法檢測(cè)miR-124的表達(dá)。相應(yīng)引物序列miR-124 F：5’-ACTCGGCTCGTGGCACTCC-3’，R：5’-ATACCGCGGATTTGGACGCC-3’；U6 為F：5’-TATCCGTCGGCAGCCTAGGGACG-3’，R：5’-ATGCGCAACGTAATGGCTGGCA-3’。目的基因的表達(dá)采用相對(duì)定量法，即以U6 RNA作為內(nèi)參，結(jié)果數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法分析。

1.8熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 利用生物信息預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-124和EZH2的結(jié)合片段。將擴(kuò)增的EZH2 mRNA 的3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)插入到pMIR-reporterTM 的miRNA 表達(dá)載體(Applied Biosystems)中，將上述熒光素酶報(bào)告載體及突變載體miR-124 NC及miR-124 mimics共同轉(zhuǎn)染至786-O細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后，采用熒光素酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞的熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1miR-124在腎癌組織及癌旁正常組織中表達(dá) 62例腎癌及癌旁正常組織標(biāo)本中，與癌旁正常組織相比，腎癌組織中miR-124 mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 腎癌與癌旁正常組織中miR-124的表達(dá)

2.2腎癌組織中miR-124的表達(dá)水平與腎癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 根據(jù)miR-124在腎癌組織標(biāo)本中的平均表達(dá)量，將入選患者分為miR-124高表達(dá)組(28例)和低表達(dá)組(34例)。采用χ2檢驗(yàn)分析miR-124的表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示，miR-124的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。見表1。

表1 miR-124表達(dá)水平與腎癌患者臨床病理特征的相關(guān)性(n)

2.3過表達(dá)miR-124對(duì)腎癌786-O細(xì)胞增殖、遷移以及侵襲水平的影響 結(jié)果顯示，與miR-124 NC相比，miR-124 mimics組786-O細(xì)胞中增殖、遷移以及侵襲水平明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：與miR-124 NC比較，*P<0.05。

圖2過表達(dá)miR-124 對(duì)786-O細(xì)胞增殖、遷移以及侵襲水平的影響

2.4miR-124 與EZH2 mRNA 3’非編碼區(qū)的互補(bǔ)配對(duì)序列 采用靶基因網(wǎng)站對(duì)miR-124的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，miR-124與EZH2基因mRNA 3’非編碼區(qū)之間存在互補(bǔ)配對(duì)。熒光素酶報(bào)告結(jié)果進(jìn)一步顯示，與miR-124 NC相比，miR-124共轉(zhuǎn)染的786-O細(xì)胞中，EZH2-WT表達(dá)水平明顯降低，而EZH2-MUT相對(duì)熒光素酶活性無明顯變化，表明miR-124是通過結(jié)合EZH2基因的3'UTR調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)。見圖3。

注：與miR-124 NC比較，*P<0.05。

圖3miR-124與EZH2 mRNA 3’非編碼區(qū)的互補(bǔ)配對(duì)序列

2.5過表達(dá)miR-124對(duì)EZH2蛋白表達(dá)水平的影響 采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)miR-124 對(duì)腎癌786-O細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與miR-124 NC比較，miR-124 mimics組明顯降低了EZH2的表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：與miR-124 NC比較，*P<0.05。

圖4過表達(dá)miR-124對(duì)786-O細(xì)胞中EZH2蛋白水平的影響

3 討 論

腎癌的病理過程較為復(fù)雜，其相關(guān)的多種危險(xiǎn)因素包括吸煙、飲酒、高血壓、肥胖以及環(huán)境因素等，是一個(gè)多階段及多途徑改變的發(fā)展過程[6]。盡管外科手術(shù)是治療局限性腎癌的首選方法，但大多數(shù)腎癌患者初期癥狀通常較為隱蔽且沒有典型的癥狀，高達(dá)1/3的腎癌患者在診斷時(shí)已經(jīng)轉(zhuǎn)移，而近40%的局部病變患者在手術(shù)治療后復(fù)發(fā)[7-8]。研究[9]顯示miR-124在多種器官的腫瘤組織中異常表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。L.P.Wu等[10]在研究中發(fā)現(xiàn)，miR-124在肝癌組織中表達(dá)與腫瘤的分級(jí)分期呈負(fù)相關(guān)，通過靶向KLF4抑制肝癌進(jìn)展并有望成為一種新的診斷標(biāo)志物；Y.Zhao等[11]研究顯示miR-124在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)明顯低于癌旁組織，并呈外源性表達(dá)。miR-124可直接調(diào)控細(xì)胞中SphK1活性，導(dǎo)致增殖水平減少，集落形成延遲，腫瘤生長(zhǎng)減慢；F.Tian等[12]研究表明miR-124通過靶向GATA6基因的表達(dá)，使膽管癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力下降。本研究中，我們首先分析檢測(cè)腎癌組織及癌旁組織中miR-124的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)腎癌患者組織中miR-124表達(dá)明顯低于癌旁正常組織。接下來，我們分析了腎癌組織中miR-124的表達(dá)水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果提示低表達(dá)水平的miR-124與腫瘤的高組織學(xué)分級(jí)、高臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性密切相關(guān)，而與患者的性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目等均無關(guān)。此外，在786-O細(xì)胞中過表達(dá)miR-124后，細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力明顯降低，提示miR-124可能與腎癌的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)，在腎癌中可能扮演了“抑癌基因”的角色。

EZH2基因也稱ENX-1，編碼在人體染色體7q35上，是多梳蛋白抑制復(fù)合體2(PcG，polycomb group)基因家族重要成員之一。其通過催化組蛋白H327位點(diǎn)的三甲基化(H3K27me3)，對(duì)相關(guān)靶基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制的作用[13-14]。L.Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)EZH2在腎癌中促進(jìn)了細(xì)胞的遷移和侵襲，是晚期腎癌的潛在的治療靶點(diǎn)；另有文獻(xiàn)報(bào)道EZH2參與了乳腺癌的進(jìn)展且高表達(dá)的EZH2與患者生存不良明顯相關(guān)，表明EZH2可作為乳腺癌患者的預(yù)后生物標(biāo)志物和靶點(diǎn)[16]。S.Liu等[17]研究顯示EZH2在食管癌S100A4細(xì)胞中具有促進(jìn)遷移和增殖的作用，提示ECH2在食管癌中扮演了“促癌基因”的角色。為進(jìn)一步探討miR-124抑制腫瘤發(fā)生的機(jī)制，本研究通過腎癌786-O細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討了miR-124和EZH2的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-124后，EZH2蛋白表達(dá)下調(diào)，提示miR-124可能通過靶向EZH2的表達(dá)起到抑制腫瘤的作用。

綜上所述，miR-124的異常表達(dá)可能與腎癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，可能是靶向調(diào)控EZH2的表達(dá)以影響腎癌786-O細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。本研究可進(jìn)一步了解miR-124在調(diào)節(jié)腎癌進(jìn)展中的功能和分子機(jī)制，可對(duì)腎癌的臨床診斷和治療提供新的認(rèn)識(shí)。