sFRP-2抑制皮膚惡性黑色素瘤增殖的影響

趙振霞 董華君 于強 陳新 蹇露

(1.山東省聊城市第二人民醫(yī)院整形外科，山東 聊城 252600；2.湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院病理科，湖北 十堰 442000)

皮膚黑色素瘤(Cutaneous melanoma，CM)是一種極具侵襲性的癌癥，生存率低，死亡率高[1-3]。早期手術(shù)切除以及放化療為主的綜合治療是臨床中CM的主要治療方案，但CM極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的預后通常較差；且化療藥物對絕大多數(shù)CM患者沒有療效或表現(xiàn)出腫瘤耐藥性，這使得治療無效。近年來分子生物學和腫瘤表觀遺傳學的深入研究，研究者提出腫瘤的發(fā)生與癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關(guān)；各種基因的異常表達導致細胞逃避正常機體生理調(diào)控功能，出現(xiàn)增殖異常和凋亡失控等現(xiàn)象。因此臨床中尋找早期診斷與判斷CM預后的靶點具有重要意義。sFRP-2是WNT信號通路的負調(diào)控因子，是一種分泌性糖蛋白，作為一個負調(diào)控因子參與多種腫瘤細胞生長、細胞免疫、干細胞分化等[4-5]。已有文獻報道在包括頭頸部腫瘤、前列腺癌等腫瘤中具有重要的抑癌作用[6-7]。但對其參與CM的研究的甚少。本研究旨在評估sFRP-2對CM侵襲和轉(zhuǎn)移的功能和分子機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1試劑、材料儀器 胎牛血清和RAPI-1640培養(yǎng)液購自美國Gibico公司；RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa 公司；Trans5α 感受態(tài)細胞、293T 細胞購自天根生化科技有限公司; Lipofectamine 3 000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen 公司;慢病毒質(zhì)粒載體pLVX-IRES-ZsGreen1 購自美國ProliantProliant公司；質(zhì)粒載體sFRP-2、質(zhì)粒載體包裝質(zhì)粒購自上海碧云天實驗公司; CCK-8 試劑盒購自日本同仁化學實驗公司。實驗用一抗、二抗均購自美國Abcam 公司。sFRP-2 基因引物由廣州復能基因公司設計并合成。

1.2細胞系和臨床組織樣本 黑色素瘤細胞系(HM、A375、WM451和SK-MEL-1)購自上海生科院細胞庫；對2005年1月至2018年12月于本院收治并由兩名以上病理科高年資醫(yī)師確診的并收治的共80例CM患者的臨床病例樣本。在這些患者中男49例以及女31名。年齡范圍在29～76歲之間，中位年齡49.7歲。所有病人臨床分期依據(jù)第8版AJCC版TNM分期，其中Ⅰ期13例、Ⅱ期22例、Ⅲ期28例及Ⅳ期17例。在2005～2018年的持續(xù)隨訪過程中共死亡56例，存活24例。本研究得到了我醫(yī)院的倫理委員會的批準，組織標本診斷由我院病理科高年制醫(yī)師診斷。

1.3實驗方法

1.3.1細胞和組織RNA和蛋白提取 CM細胞和組織的RNA和蛋白以及上述臨床樣本中RNA和蛋白提取步驟同已有的文獻報道[8-9]。提取后RNA在Landdrop儀器中測得濃度，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，實驗方法及步驟參考樣品實驗說明書及已有的參考文獻[10]。將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA放于-20 ℃冰箱中保存。

1.3.2sFRP-2過表達載體構(gòu)建和細胞感染 慢病毒感染方法和步驟同參考文獻[11-12]。取細胞狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的293T細胞接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);參照Lipofectamine 3 000使用說明，將包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染后8h更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后；收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，進行細胞感染。慢病毒感染方法：取活性狀態(tài)下A375細胞，將慢病毒上清液置于A375細胞中共培養(yǎng)約6～8 h，更換完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進行細胞功能實驗。

1.3.3免疫組化實驗 免疫組化方法和步驟同參考文獻[13]，主要包括了：組織切片脫蠟(3 μm，60 ℃，2 h)、脫缸(10 min/次)、抗原修復[熱誘導抗原表位修復、檸檬酸鹽緩沖液(pH=6)，30 min]、H2O2室溫下封閉(室溫下2h)、孵一抗(4 ℃凍庫，12 h)和二抗(37 ℃，2 h)、DAB顯色(室溫下5 min)、染核(蘇木紫及伊紅復染，室溫下5 min)、封片鏡檢等。在倒置顯微鏡下隨機5個視野，計算相對光密度。選用已知陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。根據(jù)病理評分標準：獨立評估陽性腫瘤細胞的相對數(shù)量(范圍：0%～100%)和染色強度(范圍：0～3分：0分=無染色，1分=弱染色，2分=中度染色，3分=強染色)。

1.3.4qRT-PCR檢測sFRP-2在組織表達 qRT-PCR的步驟同試劑盒使用說明書和文獻所述[14-15]。sFRP-2-F：5’-CGTCAGAAGAAGCTGCTGCTCC-3’，sFRP-4-R：5’-TAATGGTCTCCACAGCACTCATA-3’。使用HT7500生物系統(tǒng)以及SYBRGreen的試劑盒。通過實時監(jiān)測PCR擴增，選擇β-actin為內(nèi)參基因，每個樣品做三個重復；用2-△△Ct法對樣本基因進行表達差異相對定量分析，在擴增的指數(shù)期對起始模板進行定量，擴增指數(shù)越高，相對表達越高。

1.3.5細胞增殖實驗 對照組和實驗組的細胞處理同前，取對數(shù)生長期的細胞進行消化，按每孔3 000 個細胞接種96孔板，完全培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。待細胞完全貼壁后，實驗前3 h在各孔中分別加入20 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)0、24、48和72 h時分別檢測細胞增殖活性，通過酶聯(lián)免疫檢測儀在波長480 nm 處檢測各孔的D值，根據(jù)D480 nm值繪制細胞生長曲線。

1.3.6軟瓊脂平板克隆實驗 軟瓊脂平板克隆實驗方法和步驟同參考文獻[15]。取對數(shù)生長期實驗組和對照組細胞，消化、離心、計數(shù)；將細胞稀釋成1×103細胞/mL備用。蒸餾水分別制備出1.3%和0.8%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液。分別使用1∶1比例將瓊脂糖液與1 640完全培養(yǎng)液混合后，平鋪于平皿中自然冷卻凝固形成雙側(cè)瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置于細胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)約兩周；觀察克隆形態(tài)并計數(shù)。以上實驗組和對照組各重復三次。

1.3.7免疫蛋白印跡實驗 蛋白質(zhì)印跡法檢測 A375在細胞系中的相對表達：收集實驗組和對照組，提取細胞蛋白后測定蛋白濃度[16]。取50 μg/孔細胞蛋白進行凝膠電泳，常溫下將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)膜于PVDF膜上，5%脫脂牛奶的TBST室溫下封閉2 h，加入一抗及內(nèi)參GAPDH(美國Abcam公司)，4 ℃凍庫封閉過夜。24 h后常溫下復溫約30 min，TBST液洗膜后，二抗封閉液室溫下?lián)u床孵育2 h，顯色劑(DAB)顯色、成像儀曝光，并用Quantity One軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH之比來表示相對表達差異。

2 結(jié) 果

2.1sFRP-2 mRNA在黑色素瘤細胞系和組織中的表達 qRT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)，與正常色素痣相比，sFRP-2 mRNA在黑色素瘤細胞系中表達下調(diào)(圖1A，P<0.001)，差異具有統(tǒng)計學意義。同時qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，sFRP-2 mRNA在黑色素瘤組織中表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(圖1B，P<0.001)，差異具有統(tǒng)計學意義。

(A)qRT-PCR顯示：與色素痣相比，sFRP-2 mRNA在黑色素瘤細胞中表達下調(diào)；***P<0.001.(B)qRT-PCR顯示：與癌旁組織相比，sFRP-2 mRNA在黑色素瘤組織中低表達，P<0.001。

圖1sFRP-2 mRNA 的表達

2.2sFRP-2 蛋白在黑色素瘤組織中的表達 通過免疫組織化學分析80例黑色素瘤組織和色素痣的蛋白相對表達；結(jié)果顯示：與色素痣相比，sFRP-2 蛋白在黑色素瘤組織中表達下調(diào)(圖2A)，差異具有統(tǒng)計學意義。通過IPP 6.0軟件分析 sFRP-2 蛋白表達光密度顯示，與色素痣組織相比(0.324±0.012)，sFRP-2 在黑色素瘤中光密度降低(0.123±0.034)(圖2B，t=15.34，P<0.01)。

(A)與正常色素痣相比，sFRP-2 蛋白在黑色素瘤中表達下調(diào)；(B)光密度分析：sFRP-2 蛋白在黑色素瘤中表達下調(diào)，P<0.01。

圖2sFRP-2 蛋白在黑色素瘤中的表達

2.3sFRP-2蛋白表達與患者臨床特征的關(guān)系 sFRP-2 的表達與不同性別、不同年齡的基線特征無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)；隨著病理分級增加，sFRP-2 蛋白在黑色素瘤組織中陽性率逐步降低，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.034)。見表1。

表1 臨床特征與 sFRP-2 蛋白表達的關(guān)系

2.4sFRP-2表達對患者生存時間的影響 sFRP-2 高表達患者中位生存時間為 56.12 個月，其三年存活率為56.78%; sFRP-2 低表達患者中位生存時間為 26.62 個月，其三年存活率為22.19%。Log-Rank 檢驗結(jié)果提示 sFRP-2 高表達患者與 sFRP-2 低表達患者生存時間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 sFRP-2 蛋白的表達情況與K-M 生存曲線

2.5sFRP-2 基因過表達對黑色素瘤細胞增殖的影響 我們對黑色素瘤細胞 A375 進行 sFRP-2 基因過表達，免疫蛋白印跡實驗驗證了sFRP-2的過表達(圖4A)。CCK-8實驗結(jié)果顯示，實驗組 A375 細胞感染sFRP-2后細胞存活率顯著下降(圖4B，P<0.01)；克隆形成實驗結(jié)果顯示，實驗組 A375 細胞克隆形成的效率顯著下降(圖4C，P<0.001)。

(A)免疫蛋白印跡實驗驗證sFRP-2在A375中的過表達；(B)CCK-8實驗sFRP-2抑制細胞活性，P<0.01；(C)軟瓊脂平板克隆顯示sFRP-2 在抑制細胞克隆的形成，***P<0.001。

圖4sFRP-2表達對黑色素瘤細胞A375增殖的影響

2.6過表達sFRP-2對 Wnt/β-catenin 信號通路的影響 通過免疫蛋白質(zhì)印跡檢測過表達 sFRP-2 后對active-β-catenin及下游靶基因的影響，結(jié)果顯示：過表達 sFRP-2 后，active-β-catenin及下游靶基因c-Myc、cyclinD1的表達明顯受到抑制；同時細胞周期相關(guān)蛋白p21 和 p27等表達上調(diào)(圖5A，5B，P<0.001)。

(A)免疫蛋白印跡實驗分析過表達sFRP-2對Wnt/β-catenin信號通路的影響；(B)灰度定量分析過表達sFRP-2對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)靶點的影響，兩組比較，***P<0.001。

圖5sFRP-2 過表達后對Wnt/β-catenin信號通路的影響

3 討 論

黑色素瘤的發(fā)病率在皮膚腫瘤中僅次于鱗狀細胞癌和基底細胞癌，是最常見的三種皮膚癌的類型之一。其具有高度轉(zhuǎn)移潛能，能在淋巴結(jié)、肝、肺和腦等部位發(fā)生轉(zhuǎn)移；是目前死亡率最高的皮膚腫瘤。盡管發(fā)病率不高，但世界范圍內(nèi)患有黑色素瘤的人數(shù)不斷增加，且黑色素瘤患者的預后仍不理想，平均生存期不到6個月。針對黑色素瘤的治療方法取得了巨大的發(fā)展：包括達巴芬尼、維穆拉芬尼和曲美替尼等激酶抑制劑用于BRAF V600E突變患者，單克隆抗體，PD-1的免疫治療等[17]。但黑色素瘤患者的預后和生存率仍然不佳。因此，迫切需要尋找早期預測黑色素瘤發(fā)生發(fā)展和預后的治療靶點。

Wnt 信號調(diào)節(jié)因子 sFRPs 因其在腫瘤中的作用而備受關(guān)注。作為sFRPs家族成員之一，sFRP-2作為一種抑制基因在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。文獻報道[18]， sFRP-4在頭頸部/口腔鱗狀細胞癌中表達上調(diào)；高表達的sFRP-4在頭頸部/口腔鱗狀細胞癌容易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移且預后較差。sFRP-5在黑色素瘤中低表達，sFRP-5 的表達可能在黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮潛在的作用，并作為人類黑色素瘤治療的一個有希望的靶點[18]。但 sFRP-2表達對黑色素瘤的影響尚未見報道和研究。

本研究首先通過qRT-PCR 和免疫組化法分別檢測了 sFRP-2 在黑色素瘤細胞系和組織中相對表達，結(jié)果顯示：sFRP-2 在黑色素瘤細胞和組織中的表達下調(diào)，并可能在黑色素瘤進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，我們采用慢病毒轉(zhuǎn)移來過表達 sFRP-2，通過CCK-8和軟瓊脂平板克隆實驗驗證 sFRP-2對黑色素瘤細胞的直接生物學效應。結(jié)果表明，sFRP-2 的過度表達能明顯抑制細胞增殖和細胞活性。同時，對 sFRP-2 表達的臨床病理特征進行了進一步分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在排除了性別、年齡與 sFRP-2 表達可能存在的相關(guān)性的情況下，sFRP-2 表達可能與黑色素瘤的生存有密切的關(guān)聯(lián)。有研究認為在一些腫瘤中 sFRP-2 高表達能增加患者的生存期，本本研究得到了相似的結(jié)論。文獻研究顯示，sFRPs 家族對多種腫瘤的Wnt信號都有拮抗作用，我們通過 Western blot 分析檢測了 A375 細胞中 Wnt 信號通路的蛋白表達水平，以探討 sFRP-2 抑制黑色素瘤細胞增殖的分子機制。結(jié)果顯示sFRP-2 的過表達下調(diào)了 Wnt/β-catenin 及相關(guān)通路中關(guān)鍵因子的蛋白表達，表明 sFRP-2 抑制了典型 Wnt 信號。

綜述，本課題研究顯示 sFRP-2 基因在黑色素瘤組織中表達下調(diào)，過表達 sFRP-2 基因后能通過抑制Wnt/β-catenin來調(diào)控黑色素瘤的進展；可能作為重要的腫瘤性基因參與黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展。