自噬在高尿酸致血管內(nèi)皮細胞損傷及炎癥反應(yīng)中的作用

陳元椿 張創(chuàng)良 吳清權(quán)

(海南省干部療養(yǎng)院 海南省老年病醫(yī)院重癥監(jiān)護室，海南 海口 571100)

動脈粥樣硬化(AS)是發(fā)生冠心病及出血性腦卒中的病理基礎(chǔ)〔1,2〕。同時，隨著我國人民生活水平的日益提高，高尿酸血癥的患病率也在持續(xù)上升，特別是一些城市較發(fā)達的地區(qū)，高尿酸血癥的檢出高達5.0%～23.5%，已經(jīng)接近發(fā)達國家水平〔3〕。血管內(nèi)皮細胞損傷是AS等疾病發(fā)病的病理基礎(chǔ)及早期環(huán)節(jié)〔4〕，有研究表明〔5〕，尿酸(UA)刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞后可以引起細胞炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1 及細胞黏附因子表達增加，因此炎癥反應(yīng)在高UA致心血管疾病中起到了重要作用，進而參與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。自噬是一種普遍存在于真核細胞內(nèi)的一個動態(tài)過程，主要用于維持并修復(fù)自身代謝。大量研究資料顯示自噬能夠參與AS的發(fā)生發(fā)展、炎癥反應(yīng)及代謝應(yīng)激〔6〕，有研究報道〔7〕，自噬可以通過負調(diào)控炎性體，進而限制IL-1β 等炎癥因子的表達。本研究旨在探討自噬在高UA導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1細胞株 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)購于美國ATCC公司。

1.2試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)；小牛血清(FBS，GIBCO公司)；FITC標記羊抗鼠二抗(life公司)；UA，3-甲基腺嘌呤(MA)，丹酰戊二胺(MDC)，吖啶橙(AO)，微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC)3、自噬相關(guān)蛋白(beclin)1、β-actin單克隆抗體購自(Sigma公司)；細胞間黏附因子(ICAM)-1檢測試劑盒、細胞內(nèi)黏附因子(VCAM)-1檢測試劑盒及IL-6檢測試劑盒(CUSABIO公司)。熒光倒置顯微鏡 (IX53，OLYPUS公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo 公司)；生物超凈工作臺(life science公司)；電熱恒溫水槽(Yuan More公司)；凝膠成像系統(tǒng)，電泳儀(Tanon公司)；低溫高速離心機(Thermo公司)；96孔板(costar公司)；酶標儀(Bio-Rad 公司)；CountessTM自動細胞計數(shù)儀(C10281，Invitrogen公司)。

1.3細胞培養(yǎng)和分組干預(yù) 將HUVEC細胞于37℃，5% CO2條件下，用含10% FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞瓶內(nèi)細胞生長回合度到達85%以上后，用含有乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化液消化細胞并進行傳代，使用CountessTM自動細胞計數(shù)儀將HUVEC調(diào)整為1×106/ml后平鋪6孔板，同時按實驗分組，加入UA及自噬調(diào)控劑處理(UA終濃度為0.25 g/L，3-MA終濃度為10 μmol/L)，實驗共分為3組，即對照組，UA組，UA+3-MA組(每組平行設(shè)立3個復(fù)孔)。

1.4HUVEC自噬染色 將對數(shù)生長期的HUVEC消化制成細胞懸液后，以每孔1×106細胞數(shù)接種于6孔板中,待細胞貼壁生長匯合達到85%后，將UA加入含HUVEC的培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)24 h后進行自噬檢測，PBS洗3遍，棄上清，以4%的多聚甲醛，4℃下固定20 min，PBS洗2遍，分別加入終濃度為0.5 μg/ml的吖啶橙(AO)避光染色15 min后棄去染液及終濃度為 50 μg/L丹酰戊二胺(MDC)，37℃孵育 60 min，PBS洗2遍后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.5Western印跡檢測自噬相關(guān)蛋白beclin1 和LC3I/Ⅱ的表達 將不同實驗組HUVEC收集并提取總蛋白，蛋白定量后按3∶1的比例加入4×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液，用渦旋儀混勻后于100℃沸水中煮沸5 min，以30 μg蛋白每孔進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜完成后用(TBST)洗滌液清洗3次，每次5 min，5% 脫脂奶粉的封閉液，37℃封閉2 h，用TBST洗滌3次，一抗4℃孵育過夜(LC3,beclin 1，β-actin單抗以1∶1 000倍稀釋)，TBST洗膜3次，孵育含有辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠免疫球蛋白(Ig)G 抗體(二抗體稀釋度1∶5 000)，室溫搖床振搖1 h，通過成像系統(tǒng)檢測Western印跡結(jié)果。用Image Lab軟件讀取分析各蛋白條帶的灰度值，以空白對照組為參照，計算實驗處理組蛋白的相對表達量。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞黏附因子及IL-6和TNF-α表達 經(jīng)UA及自噬抑制劑處理后，實驗步驟參照試劑盒說明書，采用ELISA雙抗體夾心法檢測上清液中細胞間黏附因子(ICAM)-1，IL-6，TNF-α和細胞內(nèi)黏附因子(VCAM)-1的變化，通過酶標儀檢測樣本的OD值，波長采用450 nm，并繪制標準曲線，將實驗樣本檢測到的OD值帶入標準曲線計算公式即可算出標本中的濃度。

1.7統(tǒng)計分析 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1HUVEC培養(yǎng)及鏡下觀察 使用CountessTM自動細胞計數(shù)儀將HUVEC調(diào)整為1×106/ml，接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，HUVEC呈貼壁生長，形態(tài)呈多邊形鵝卵石形鑲嵌排列，細胞輪廓清晰，折光性較好，生長約至48 h，細胞匯合度達到85%以上。見圖1。

2.2HUVEC自噬染色 AO熒光染色在藍光(502 nm)的激發(fā)下，酸性自噬體發(fā)橘紅色熒光，堿性物質(zhì)則為綠色熒光。MDC是自噬的特異性染料，熒光染色為亮綠色(355 nm)。通過自噬染色并對自噬泡進行計數(shù)得出結(jié)果(見圖2、表1)，在培養(yǎng)24 h后，對照組HUVEC內(nèi)自噬體數(shù)量較少，熒光強度較低；UA組的HUVEC染色后，自噬泡數(shù)量明顯增加，熒光強度增強，與對照組相比明顯升高(t=7.61、8.49，P<0.01)；UA+3-MA處理組自噬則被明顯抑制。

圖2 吖啶橙和丹酰戊二胺熒光染色檢測HUVEC自噬的變化(×400)

組別AO染色MDC染色對照組2.04±0.073.24±0.11UA組12.36±1.951)14.28±2.131)UA+3-MA組6.45±1.528.12±1.17

與對照組比較：1)P<0.001；表3同

2.3Western印跡檢測自噬相關(guān)蛋白beclin1 和LC3Ⅰ/Ⅱ的表達 經(jīng)灰度值計算分析，與對照組相比，以濃度為0.25 μg/L的UA處理HUVEC 24 h后，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比值明顯增加了4.64倍，beclin 1 表達量增加3.62倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.52,P<0.01)，而加入自噬抑制劑3-MA后，LC3 Ⅱ和beclin 1蛋白表達明顯下降，同時MCP-1表達也明顯被抑制，見圖3、表2。

圖3 Western印跡檢測HUVEC自噬蛋白LC3，beclin1蛋白的表達水平

2.4UA對ICAM-1，VCAM-1及IL-6和TNF-α表達影響 與對照組相比，高濃度的UA刺激HUVEC 24 h后，細胞炎癥因子IL-6、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1表達水平明顯增加(t=62.58、18.44、25.75、46.15，均P<0.01)；在加入自噬抑制劑3-MA后，細胞炎癥因子及黏附因子明顯下降，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 Western印跡檢測自噬相關(guān)蛋白beclin1 和LC3I/Ⅱ的表達水平

與對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.001;與UA組比較：3)P<0.05

表3 ELISA法檢測HUVEC細胞IL-6，TNF-α及ICAM-1，VCAM-1的表達水平

3 討 論

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示〔8〕，高尿酸血癥與高血壓、冠心病、出血性腦損傷、代謝綜合征、腎臟損傷等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，高尿酸血癥是血管內(nèi)皮細胞損傷及炎癥發(fā)生的重要危險因素〔9〕，目前已被公認是AS的主要發(fā)病機制之一，主要研究的機制包括：UA直接易從血液中析出并沉積于血管內(nèi)皮上，造成損傷；參與炎癥反應(yīng)，刺激內(nèi)皮細胞及單核細胞產(chǎn)生IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子；促進血小板黏附聚集于血管內(nèi)壁。

研究表明，自噬及其相關(guān)信號通路在AS的發(fā)生發(fā)展中起到非常重要的作用〔10〕，通常血管內(nèi)皮細胞在正常細胞自噬情況下，能夠維持血管功能和形態(tài)，由于自噬過程中的溶酶體能夠降解低密度脂蛋白(LDL)等，從而降低患者AS發(fā)生的概率及阻礙發(fā)展進程〔11,12〕。細胞自噬被阻滯或者過度激活都會改變血管內(nèi)皮細胞的生物學(xué)功能，并且易引起纖維帽變薄，抑制膠原纖維的合成，從而導(dǎo)致AS斑塊的不穩(wěn)定。本研究結(jié)果提示UA可促進血管內(nèi)皮細胞自噬。

AS發(fā)生發(fā)展的機制非常復(fù)雜，現(xiàn)有研究認為是由于細胞趨化因子、炎癥因子及活性代謝產(chǎn)物等多重因素作用所導(dǎo)致，其中MCP-1因其對單核細胞具有很強的趨化活性，進而介導(dǎo)其黏附并遷徙入血管內(nèi)膜下層。本實驗研究結(jié)果提示自噬在調(diào)控UA誘導(dǎo)HUVEC分泌MCP-1蛋白中可起到重要作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)在冠心病、出血性腦卒中尤其是AS發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，現(xiàn)已經(jīng)被公認是AS形成的早期重要標志〔13,14〕，多種炎癥細胞和炎性介質(zhì)在AS早期發(fā)揮著重要的作用，在加快AS的發(fā)展進程的同時，也在加快動脈粥樣硬化斑塊的去穩(wěn)定性〔15〕。本研究結(jié)果提示自噬在UA誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞炎癥因子和黏附因子表達中，起到重要的作用。從以上研究結(jié)果可以得出，自噬參與并調(diào)控血清UA誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷及炎癥反應(yīng)，細胞自噬可作為研究靶點，作為防治AS的方向之一。