miR-200c靶向程序性死亡蛋白配體1基因抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力

孔曉靜

(山東省東明縣中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科,山東 東明 274500)

近年來我國結(jié)腸癌發(fā)病率及病死率呈上升趨勢〔1,2〕，腫瘤逃避機(jī)體免疫監(jiān)視是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，程序性細(xì)胞死亡蛋白 (PD)-1與配體(PD-L1)結(jié)合后使T細(xì)胞受體信號通路多個(gè)關(guān)鍵的信號分子去磷酸化，從而抑制免疫應(yīng)答〔3,4〕，PD-1/PD-L1 抗體藥物納武單抗是目前消化系統(tǒng)腫瘤免疫治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)，已有研究報(bào)道m(xù)iRNA 作為表觀遺傳調(diào)控的重要成員，通過調(diào)控 PD-1/PD-L1的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲〔5,6〕，本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測PD-L1分子在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)狀況，并與臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析，初步探索 miR-200c靶向調(diào)控PD-L1基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集山東省東明縣中醫(yī)醫(yī)院2016年1月至2017年12月行結(jié)腸癌根治術(shù)47例患者的癌組織、癌旁組織(距腫瘤邊緣大于5 cm)組織標(biāo)本，47例患者中男32例，女15例，平均年齡(52.6±8.4)歲，升結(jié)腸癌17例，橫結(jié)腸癌5例，降結(jié)腸癌13例、乙狀結(jié)腸癌12例，患者均為初始治療，術(shù)前未接受放化療治療，術(shù)后病理證實(shí)為結(jié)腸惡性腫瘤。結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2主要試劑 10%胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)液(美國Gibco公司)、 LipofectamineTM3000脂質(zhì)體、miR-200c模擬物(上海生工生物工程有限公司合成)、侵襲小室(美國Sigma公司)、雙熒光報(bào)告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)、鼠抗PD-L、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3免疫組化法檢測結(jié)腸癌組織中PD-L1蛋白的表達(dá) 取47例結(jié)腸癌患者手術(shù)標(biāo)本，常規(guī)、脫蠟水化、高溫抗原修復(fù)、封閉，加入兔抗人PD-L1單克隆抗體、二抗孵育、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、封片，結(jié)腸癌組織標(biāo)本的免疫組化切片均由2名資深病理科醫(yī)生獨(dú)立雙盲觀察，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清的DMEM培基中，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，通過TargetScan 靶基因預(yù)測庫預(yù)測 miR-200c能與PD-L1 的3′-UTR 結(jié)合，取對數(shù)生長期結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，0.25%胰酶消化后將細(xì)胞分成3組，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染 miR-200c mimic，陰性對照組轉(zhuǎn)染 miR-NC，空白對照組為正常培養(yǎng)LoVo細(xì)胞。將上述3組細(xì)胞利用LipofectamineTM3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，根據(jù)Trizol試劑盒說明書提取總RNA，按照Invitrogen試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參，用Real-time PCR法檢測細(xì)胞中miR-200c、PD-L1 mRNA的表達(dá)，miR-200c、PD-L1的引物序列見表1。

表1 β-actin、miR-200c、PD-L1的引物序列

1.5熒光素酶報(bào)告基因檢測各組雙熒光素酶活性 將含有miR-200c結(jié)合位點(diǎn)PD-L1的3′-UTR片段插入pGL-3熒光素酶報(bào)告基因載體，構(gòu)建野生型和突變型的熒光素酶報(bào)告載體，分別將miR-200c、miR-NC和pGL-3熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，共3組細(xì)胞：①miR-200c mimic+pGL-3 PD-L1 3′-UTR-Wt(轉(zhuǎn)染組)；②miR-NC mimic+pGL-3 PD-L1 3′-UTR-Wt(陰性對照組)；③空白對照組細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照Promega公司雙熒光素酶檢測方法進(jìn)行檢測。

1.6Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力 將轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染 miR-200c mimic，陰性對照組轉(zhuǎn)染 miR-NC，空白對照組為正常培養(yǎng)LoVo細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h后，0.25%胰酶消化，接種到Transwell上室后加入DMEM培養(yǎng)基，下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，取出 Transwell小室，沖洗、固定、染色后，倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.7統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析，PD-L1與臨床病理特征的相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PD-L1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系 PD-L1主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞(圖1)，結(jié)腸癌組織中PD-L1蛋白表達(dá)陽性率為55.3%(26/47)，顯著高于癌旁組織〔27.7%(13/47)〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.406，P=0.006 5)。結(jié)腸癌組織中PD-L1蛋白表達(dá)與腫瘤分化(χ2=6.021，P=0.031 2)、pN分期(χ2=7.141，P=0.003 7)、T分期有關(guān)(χ2=8.073，P=0.044 5)，與患者年齡、性別、腫瘤最大徑、腫瘤部位無明顯相關(guān)性(表2)。

圖1 PD-L1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)(DAB，×400)

表2 PD-L1表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性(n)

2.2miR-200c靶向調(diào)控結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞PD-L1的表達(dá) 轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染 miR-200c mimic后，細(xì)胞內(nèi)miR-200c的表達(dá)明顯上升，miR-200c水平(2.23±0.52)較空白對照組(0.43±0.12)、陰性對照組(0.51±0.15)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=57.45，P<0.000 1)，表明miR-200c mimic在結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中高表達(dá)，已成功轉(zhuǎn)染 miR-200c mimic。miR-200c mimic轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)PD-L1的表達(dá)下降至(0.27±0.06)，與空白對照組(1.12±0.38)、陰性對照組(1.35±0.44)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=19.14，P=0.000 2)。miR-200c mimic轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性(0.38±0.11)，明顯低于空白對照組(1.01±0.09)、陰性對照組(1.05±0.10)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=118.2，P<0.000 1)。

2.3miR-200c對LoVo細(xì)胞侵襲能力的影響 miR-200c mimics 轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌 LoVo細(xì)胞48 h后，細(xì)胞遷移數(shù)目(156±43.6)明顯低于空白對照組(239±59.8)、陰性對照組(274±61.9)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.102，P=0.006 8)。

3 討 論

腫瘤免疫治療通過活化特異性T淋巴細(xì)胞，激活和增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，是最新而且有效的腫瘤治療手段〔7，8〕。PD-1是表達(dá)于T細(xì)胞表面的負(fù)共刺激信號分子，活化的PD-1通過與配體PD-L1結(jié)合，募集蛋白酪氨酸磷酸酶，使T細(xì)胞受體信號關(guān)鍵分子去磷酸化，抑制抑制免疫應(yīng)答〔3～5，9〕，多項(xiàng)研究證實(shí)PD-L1在胃癌、肝細(xì)胞癌等實(shí)體腫瘤中呈過表達(dá)狀態(tài)〔10～12〕。我們的研究發(fā)現(xiàn)47例結(jié)腸癌組織中PD-L1蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度有關(guān)，與患者年齡、性別、腫瘤直徑大小、腫瘤部位無明顯相關(guān)性，提示PD-L1可能與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

PD-L1是一種由290個(gè)氨基酸構(gòu)成的跨膜蛋白，基因定位于染色體9p24，胞外區(qū)含有與PD-1結(jié)合的結(jié)構(gòu)域〔13〕。miR-200c是miR-200 家族成員之一，與家族成員miR-141成簇定位于染色體12p13，miR-200 家族通過參與腫瘤轉(zhuǎn)移的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程〔14，15〕，有研究證實(shí)miR-200b通過靶向PD-L1 3′-UTR抑制胃癌細(xì)胞內(nèi) PD-L1的表達(dá)〔16〕，提示miR-200 家族成員可能通過抑制PD-L1發(fā)揮其抑癌基因的作用。本研究通過脂質(zhì)體使結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞過表達(dá)miR-200c后，進(jìn)一步證實(shí)miR-200c在結(jié)腸癌中靶向下調(diào)PD-L1，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)，推測其原因可能與miR-200c下調(diào)PD-L1后，結(jié)腸癌腫瘤轉(zhuǎn)移和免疫逃逸能力增強(qiáng)，提示miR-200c介導(dǎo)的PD-L1基因沉默可能與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移侵襲有關(guān)，然而其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。結(jié)腸癌是發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤，一項(xiàng)多中心結(jié)腸癌患者臨床Ⅱ期試驗(yàn)證實(shí)，PD-1/PD-L1抑制劑Pembrolizumab對氟嘧啶或伊立替康治療失敗的結(jié)腸癌患者，具有較高的疾病控制率，可能是結(jié)腸癌患者免疫治療的新方向〔17〕。免疫治療在最新腫瘤治療中嶄露頭角，免疫檢測點(diǎn)PD-1及其配體PD-L1誘導(dǎo)免疫耐受是腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵分子，雖然目前PD-1/PD-L1抑制劑Nivolumab和Pembrolizumab在消化道腫瘤的治療中應(yīng)用廣泛，但其機(jī)制仍有待于從細(xì)胞分子、基因水平進(jìn)一步加以探索，本研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度有關(guān)，miR-200c通過靶向結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞內(nèi)PD-L1 3′-UTR抑制PD-L1的表達(dá)，上調(diào)miR-200c表達(dá)可抑制結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞侵襲能力。