腎病綜合征患者腸道菌群宏基因組學(xué)

劉永平 鄭學(xué)明 王茹冰 解冰 孔德華 吳曉蓉 傅行禮

(鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)中醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212028；2江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3南京市高淳人民醫(yī)院)

人體是一個非常復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，在我們的體表、腸道和口腔中活躍著非常豐富的微生物〔1,2〕。其中，人類腸道微生物最為豐富，總數(shù)在1 012～1 014之間，是人體細(xì)胞數(shù)量的10倍〔3〕。 成年人胃腸道微生物的其中絕大部分是細(xì)菌，主要類群為擬桿菌門和硬壁菌門，而放線菌門、變形菌門和疣微菌門數(shù)量次之〔4〕。越來越多的研究表明腸道微生物與人體的健康密切相關(guān)，腸道菌群的失調(diào)可以導(dǎo)致自身免疫性疾病、過敏反應(yīng)、肥胖、炎癥性腸(IBD)、糖尿病等疾病〔5～7〕。由于絕大部分的腸道微生物無法通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)來鑒定，目前的研究手段主要是腸道宏基因組測序〔8〕。宏基因組學(xué)研究借助于大規(guī)模測序和生物信息學(xué)分析，能夠發(fā)現(xiàn)大量過去無法得到的未知微生物新基因或新的基因簇，這對于了解胃腸道微生物的群落組成、進(jìn)化歷程和代謝特點(diǎn)，挖掘具有應(yīng)用潛力的新基因具有重要意義。腎臟疾病的發(fā)生和腸道微生物有密切關(guān)系。Zheng等〔9〕發(fā)現(xiàn)克雷伯氏菌能促進(jìn)三聚氰胺對腎臟的毒性，表明患者腎衰竭與其腸道菌群的組成和代謝活動密切相關(guān)。美國學(xué)者Vaziri等〔10〕研究了尿毒癥或飲食和藥物干預(yù)慢性腎臟病對腸道微生物的改變，研究人員通過研究糞便中提取的腸道微生物的宏基因組發(fā)現(xiàn)終末期腎臟病患者和健康人兩組之間有 190種細(xì)菌的分類有顯著差異：短狀桿菌科、肉桿菌科、腸桿菌科、鹽單胞菌科等細(xì)菌在終末期腎臟病(ESRD)患者中均顯著增加。Anders等〔11〕提出了腸道菌群對慢性腎病(CKD)和ESRD患者有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用并討論了尿毒癥是如何引起患者腸道微生物組失調(diào)。腎病綜合征(NS)可由多種病因引起，最基本的特征是大量蛋白尿、低蛋白血癥、水腫和高脂血癥及其他代謝紊亂為特征的一組臨床癥候群。目前對NS患者腸道微生物宏基因組還缺少研究。本研究主要目的是應(yīng)用腸道微生物宏基因組學(xué)的方法來研究NS患者與健康人群腸道菌群在物種多樣性、菌落結(jié)構(gòu)上的差異。

1 材料與方法

1.1樣品的準(zhǔn)備和DNA的抽提 從鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)中醫(yī)院收集正常人和NS患者的糞便標(biāo)本分別為8 份和30份。糞便標(biāo)本儲存在含有DNA穩(wěn)定劑的糞便收集器中(Invitek,Germany),保存在-80℃冰箱備用。樣品中微生物宏基因組DNA的提取選擇德國Invitek公司的試劑盒PSP?Spin Stool DNA Plus Kit。提取的基因組DNA后需要經(jīng)過質(zhì)檢(1.0%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)測OD260/OD280)后可進(jìn)行下一步的 PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

1.2PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物的回收 設(shè)計(jì)細(xì)菌16S rDNA基因V3～V5區(qū)的通用引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，反向引物806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT (注：H:A/T/C,V:G/A/C,W:A/T)。為保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性及可靠性，我們選擇高保真的DNA聚合酶TransStart FastPfu DNA Polymerase(全式金生物)進(jìn)行PCR反應(yīng)并且①盡可能使用低循環(huán)數(shù)擴(kuò)增；②保證每個樣本擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)一致。首先隨機(jī)選取具有代表性的樣本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定能夠擴(kuò)增出濃度合適的產(chǎn)物的最低循環(huán)數(shù)，再用這一循環(huán)數(shù)擴(kuò)增所有樣品中的16S rDNA基因V3～V5區(qū)。每個樣本做3個重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。

1.3測序和質(zhì)控 參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行定量，再按照每個樣本的測序量要求進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。用TruSeqTM DNA樣品準(zhǔn)備試劑盒進(jìn)行Miseq文庫構(gòu)建，Illumina Miseq測序儀器上進(jìn)行雙端(PE)高通量測序。根據(jù)PE測序讀長(reads)之間的重疊關(guān)系，將成對的reads拼接成一條序列，同時對reads的質(zhì)量和合并的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到優(yōu)化數(shù)據(jù)進(jìn)行下一步的生物信息學(xué)分析。質(zhì)控參數(shù)：①過濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20 bp，從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控后50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads；②根據(jù)PE reads之間的重疊關(guān)系，將成對reads拼接成一條序列，最小重疊長度為10 bp；③拼接序列的重疊區(qū)允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；④根據(jù)序列首尾兩端的條形碼和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，條形碼允許的錯配數(shù)為0，最大引物錯配數(shù)為2。

1.4生物信息學(xué)分析 用Usearch軟件(vsesion 7.0 http://drive5.com/uparse/)對所有序列進(jìn)行優(yōu)化序列進(jìn)行OTU(Operational Taxonomic Units)劃分〔12〕。OTU分析步驟如下：①提取非重復(fù)序列；②去除沒有重復(fù)的單序列；③按照97%相似性對非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。為了得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息，采用Silva(版本128，http://www.arb-silva.de)對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并分別在各個分類學(xué)水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成〔13〕?；贠TU的注釋數(shù)據(jù)，我們得到每個樣品中物種組成、群落結(jié)構(gòu)等信息。進(jìn)一步，在I-Sanger生信云(http://www.i-sanger.com/)上統(tǒng)計(jì)分析腎病綜合征患者和正常人腸道細(xì)菌多樣性，物種組成的差異。

2 結(jié) 果

2.1PCR結(jié)果 16S rDNA的擴(kuò)增由于16S rDNA較長(1.5 kb)，我們只能對其中經(jīng)常變化的區(qū)域也就是可變區(qū)進(jìn)行測序。16S rDNA包含有9個可變區(qū)，分別是v1～v9(ref)。通過提取樣品的總基因組DNA，利用細(xì)菌16S rDNA V3～V5區(qū)(586 bp)的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，所有的樣品能擴(kuò)增出PCR條帶，位于750～500 bp。

1～30：NS患者樣本；31～38： 正常人樣本圖1 PCR電泳結(jié)果

2.2樣品測序結(jié)果及測序深度 Miseq測序得到的PE reads首先根據(jù)重疊關(guān)系進(jìn)行拼接，同時對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類分析。統(tǒng)計(jì)顯示測序讀長主要集中在420～460 bp，每個樣品中的有效序列數(shù)量為30 000多至40 000多不等。為了檢測本次測序深度，我們通過隨機(jī)抽樣法分析了各樣品的稀釋曲線。結(jié)果如圖2所示，測序的38個樣品的稀釋曲線都已趨于平緩，表明本次測序的深度基本達(dá)到要求，再增加測序的數(shù)據(jù)量對OTU的發(fā)現(xiàn)貢獻(xiàn)不大。

圖2 測序樣品的稀釋曲線

2.3腸道菌群物種多樣性分析 在所有的樣品中，細(xì)菌種類最少的不到100種，最多的不超過300種，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析患者和健康組物種多樣性，結(jié)果表明NS患者的細(xì)菌種類明顯低于健康人群，見圖3。

圖3 NS組和健康組腸道細(xì)菌種類數(shù)

2.4NS患者和健康人腸道菌群組成差異分析 基于OTU的物種注釋，進(jìn)一步對NS患者和正常人腸道細(xì)菌菌群的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明NS患者腸道芽孢桿菌綱及乳桿菌目較健康人明顯增多；而belta-變形菌綱、假單胞菌科、假單胞菌目、伯克氏菌目、鏈孢囊菌目、放線孢菌目顯著降低。見圖4。

A：NS組和健康組不同科的腸道細(xì)菌平均所占比例；B：NS組和健康組腸道細(xì)菌科級水平圖4 NS組和健康組腸道細(xì)菌科級水平差異性分析

3 討 論

正常人腸道菌群的種類有500到上千種,但我們只在每個糞便標(biāo)本中檢測到不超過300種細(xì)菌，可能的原因是我們沒能檢測到很多低豐度的細(xì)菌。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：NS組和健康組腸道菌群在門、綱、目、科、屬分類水平上都存在統(tǒng)計(jì)差異，其中目水平的差異最大；然而在物種水平上，NS組和健康組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，主要的原因是組內(nèi)不同的樣品在物種組成上差異很大。

研究表明人體胃腸道微生物的組成在出生后一年內(nèi)就已建立，一年以后嬰兒的腸道菌群就與成人相似并保持穩(wěn)定，但飲食習(xí)慣、用藥等都會影響胃腸道微生物的組成〔14〕。其實(shí)，正常人腸道菌群差異很大，所以腸道宏基因組的研究需要更大的樣本，只有更大的樣品、更多的數(shù)據(jù)才能得到更精確的結(jié)論。綜上所述，研究結(jié)果揭示了NS組和健康組腸道菌群多樣性方面有明顯差異,菌群結(jié)構(gòu)亦存在較大的差別。該研究結(jié)果為將來深入研究某一特定差異菌的對NS發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。