慢性阻塞性肺疾病患者血清炎癥因子水平及其臨床意義

黃茉莉 梅曉冬 王衛(wèi)陽

(1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院呼吸科，安徽 合肥 230000；2安徽省胸科醫(yī)院內(nèi)一科)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)可根據(jù)病情進(jìn)展分為穩(wěn)定期和急性加重期。穩(wěn)定期的主要臨床癥狀為不同程度呼吸困難，對(duì)患者肺功能及生活質(zhì)量產(chǎn)生極大危害。其中炎性細(xì)胞分泌炎癥因子參與了COPD復(fù)雜的發(fā)病過程，炎癥反應(yīng)使得氣道和肺組織炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)一步導(dǎo)致肺功能進(jìn)行性下降，出現(xiàn)呼吸衰竭甚至死亡。因此，為COPD患者提供有效的預(yù)防和治療方案對(duì)及時(shí)掌握病情，采取診治措施，減緩病情進(jìn)展，提升其生活質(zhì)量具有重要意義。本研究擬分析老年COPD患者血清中超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、血清白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12等炎癥因子水平與肺功能指標(biāo)第1秒用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)與FEV1占預(yù)計(jì)值的百分比(FEV1/Pre)的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 連續(xù)入選2017年1月至2018年1月安徽省胸科醫(yī)院COPD患者82例，根據(jù)COPD嚴(yán)重程度分級(jí)分為COPD Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)組；選擇同時(shí)期在醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診檢測的正常體檢者為對(duì)照組41例，肺功能正常，且無呼吸道及惡性腫瘤等疾病。

納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷標(biāo)準(zhǔn)遵照《慢性阻塞性肺疾病診治指南》(2013年修訂)；年齡≥54歲，性別不限；近期無感染史、手術(shù)及外傷；近期無使用抗生素或免疫調(diào)節(jié)劑者；同意簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有嚴(yán)重心臟、腦部、肝腎疾病及惡性腫瘤者；長期使用糖皮質(zhì)激素和病情嚴(yán)重需機(jī)械通氣者；其他部位存在感染者；合并其他全身性慢性疾病者。COPD組與對(duì)照組一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組基本資料比較

1.2儀器與試劑 hs-CRP測定試劑盒購自北京利德曼公司，人血清血漿α腫瘤壞死因子酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒購自上海心語生物科技有限公司，IL-8、人IL-2、人IL-4、人IL-6、人IL-12 ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司；肺功能機(jī)購自德國JAEGER公司，產(chǎn)品型號(hào)：MasterScreen。

1.3標(biāo)本采集 使用肝素抗凝管抗凝采集兩組晨起空腹?fàn)顟B(tài)時(shí)前臂外周靜脈血5 ml，3 000 r/min高速離心15 min，離心后將血清小心轉(zhuǎn)移至高壓蒸汽滅菌的EP管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4肺功能指標(biāo)FEV1/FVC與FEV1/Pre的測定 肺功能采用德國JAEGER公司MasterScreen肺功能檢測儀進(jìn)行檢測，參照肺功能檢測操作指南，由專業(yè)技師嚴(yán)格按照儀器操作說明書指導(dǎo)患者進(jìn)行檢測操作。觀察患者FEV1/Pre及FEV1/FVC。

1.5外周血TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12含量的檢測 利用ELISA檢測血清中TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12水平：將抗體用0.05 mol/L、pH9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液緩沖液稀釋至蛋白濃度為5 μg/ml。在聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加100 μl，4℃孵育過夜。次日棄去孔內(nèi)試劑，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min。將待檢血液樣品用PBS按照1∶20稀釋，取100 μl加入上述已包被好的反應(yīng)孔中，37℃孵箱孵育1 h，取出后洗滌3次。于各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體100 μl。37℃孵育1 h，洗滌5次。于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液100 μl，37℃避光孵育15 min，每孔滴入1滴2 mol/L碳酸終止反應(yīng)。在熒光檢測儀上，以空白對(duì)照孔調(diào)零，于波長450 nm處測各孔OD值，若超過陰性對(duì)照OD值的2.1倍，視為陽性。

1.6血清hs-CRP水平的檢測 利用免疫比濁法測定血清hs-CRP水平。嚴(yán)格按照CRP測定試劑盒說明書進(jìn)行操作?？扇苄悦庖邚?fù)合物在稀釋體系中聚乙二醇的作用下，由液相析出形成微粒，導(dǎo)致反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、直線相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組FEV/Pre及FEV/FVC比較 與對(duì)照組比較，COPD組FEV/Pre及FEV/FVC均顯著降低，且隨著病情分級(jí)升高，降低越嚴(yán)重(P<0.05)，見表2。

2.2各組外周血hs-CRP TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12水平 與對(duì)照組比較，COPD組hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-8指標(biāo)均顯著升高，且隨著病情分級(jí)升高，各指標(biāo)升高越明顯(P<0.05)；而IL-2只有COPD Ⅲ、Ⅳ級(jí)組與對(duì)照組及Ⅰ、Ⅱ組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，COPD Ⅰ、Ⅱ組與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)；而IL-4只有COPD Ⅳ級(jí)組與對(duì)照組及Ⅰ、Ⅱ組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，COPD Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)；COPD各組IL-12顯著低于對(duì)照組，且隨著病情分級(jí)升高，降低越明顯(P<0.05)。見表3、表4。

表2 各組FEV1/Pre及FEV1/FVC比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與COPD Ⅰ級(jí)組比較：2)P<0.05；與COPDⅡ級(jí)組比較：3)P<0.01；與COPDⅢ級(jí)組比較：4)P<0.01

表3 各組外周血血清hs-CRP、TNF-α含量比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與COPD Ⅰ級(jí)組比較：2)P<0.05；與COPDⅡ級(jí)組比較：3)P<0.05；與COPD Ⅲ級(jí)組比較：4)P<0.05；表4同

表4 各組外周血血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12含量比較

2.3患者FEV1/Pre及FEV1/FVC與血清hs-CRP、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12含量的相關(guān)性 COPD患者外周血中FEV1/FVC與hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-8呈負(fù)相關(guān)，與IL-12呈正相關(guān)(P<0.05)，F(xiàn)EV1/Pre與hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-8呈明顯負(fù)相關(guān)，與IL-12呈正相關(guān)(P<0.05)，見表5。

3 討 論

COPD是以不完全可逆并呈進(jìn)行性發(fā)展的持續(xù)存在的呼吸氣流受限為特征的慢性疾病，有害氣體或顆粒刺激氣道和肺導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)性增加，伴隨著氣道清除功能減弱，患者肺部功能嚴(yán)重下降，對(duì)患者的勞動(dòng)和生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響〔1〕。中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞均參與了COPD炎癥反應(yīng)過程，分泌炎癥因子并釋放炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步破壞肺的結(jié)構(gòu)和(或)促進(jìn)炎癥反應(yīng)〔2,3〕。研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)在COPD穩(wěn)定期患者體內(nèi)中也存在，且多發(fā)于全身多系統(tǒng)、多器官疾病，并不局限于肺部〔4〕。目前為止，COPD的主要治療方式為對(duì)癥治療，但并不能很好控制疾病癥狀、改善生活質(zhì)量。研究報(bào)道，COPD患者早期的預(yù)防和診治是控制COPD疾病進(jìn)程的關(guān)鍵〔5〕，因此發(fā)現(xiàn)更靈敏準(zhǔn)確的診斷和預(yù)后指標(biāo)成為了熱點(diǎn)研究問題。

Hs-CRP是由肝細(xì)胞合成的急性時(shí)相蛋白，機(jī)體受到組織損傷或吸入有害氣體等產(chǎn)生炎癥刺激時(shí)會(huì)大量釋放，且hs-CRP水平的上升不受放、化療及糖皮質(zhì)激素治療的影響，可間接反映患者氣流受限的程度〔6,7〕，本研究結(jié)果證實(shí)COPD患者體內(nèi)hs-CRP與肺功能指標(biāo)FEV1/FVC、FEV1/Pre均呈顯著負(fù)相關(guān)，與之前的報(bào)道相一致〔5〕。

IL-2主要由T細(xì)胞分泌，具有活化T細(xì)胞、促進(jìn)下游炎癥因子產(chǎn)生與特異性免疫反應(yīng)的作用〔8,9〕，IL-4、IL-6、IL-8等炎癥因子的分泌均與IL-2的生物學(xué)功能有關(guān)〔10〕。IL-4主要由活化的Th2細(xì)胞分泌，研究證實(shí)IL-4與痰液在無纖毛的支氣管上皮細(xì)胞積聚有密切關(guān)聯(lián)，IL-4能誘導(dǎo)乳液腺蛋白合成增加，刺激支氣管杯狀細(xì)胞的黏液分泌，引起氣道局部水腫〔11,12〕。IL-4還可以調(diào)控其他炎癥因子的表達(dá)，產(chǎn)生炎癥性抗體引起免疫應(yīng)激反應(yīng)〔13〕。有研究報(bào)道hs-CRP、IL-2和IL-4可協(xié)同發(fā)揮趨化和活化氣道黏膜中炎癥細(xì)胞的作用，產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)，參與COPD的發(fā)展過程。本研究結(jié)果提示，在COPD患者人群內(nèi)血清IL-2與IL-4尚缺乏可以指示COPD患者肺功能的直接證據(jù)。

TNF-α是一種由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子，可誘導(dǎo)氣道內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，增加黏液分泌，引起組織纖維增生并誘導(dǎo)IL-6、IL-8等細(xì)胞因子；IL-6是多功能細(xì)胞因子，常見于hs-CRP等急性期蛋白質(zhì)的合成，可以誘導(dǎo)漿細(xì)胞活化，引發(fā)全身廣泛的特異性免疫反應(yīng)，引起肺功能的降低；IL-8則對(duì)中性粒細(xì)胞具有明顯的趨化與活化功能，加重機(jī)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)〔14,15〕。據(jù)報(bào)道，IL-6〔16〕、IL-8〔15〕及TNF-α〔17〕等炎癥因子在COPD患者中亦呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，引起大量T淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞在黏膜內(nèi)聚集，參與免疫反應(yīng)及氣道炎癥，對(duì)小氣道和肺泡組織結(jié)構(gòu)和功能造成損傷〔12,18〕。本研究結(jié)果表明炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8水平可作為判斷COPD患者肺功能的指標(biāo)。

IL-12是活化自然殺傷(NK)細(xì)胞和T細(xì)胞分泌的Th1型細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)NK細(xì)胞和T細(xì)胞分泌干擾素(IFN)-γ〔12〕，可介導(dǎo)機(jī)體固有免疫與適應(yīng)性免疫〔19,20〕。研究顯示，急慢炎癥可下凋巨噬細(xì)胞分泌的IL-12，從而促進(jìn)炎癥的發(fā)展〔21,22〕。本研究結(jié)果顯示COPD患者外周血IL-12水平顯著低于對(duì)照組，且隨著COPD分級(jí)增高，IL-12下降越明顯，與肺功能指標(biāo)呈正相關(guān)，與之前的研究相一致〔5〕。

綜上，hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-12與COPD患者肺功能指標(biāo)存在顯著相關(guān)，可作為判斷COPD病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的指標(biāo)。