大分割適形放療在晚期非小細(xì)胞肺癌患者中的應(yīng)用及放療抵抗發(fā)生與血清miR-123和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體表達(dá)的關(guān)系

張利偉 石安輝 婁志霞 劉苓苓 孫瑞霞

(1中國(guó)科學(xué)院合肥腫瘤醫(yī)院腫瘤放療科，安徽 合肥 230031；2北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院放療科)

肺癌是目前全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和惡性程度最高的惡性腫瘤，我國(guó)約85%肺癌屬于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，50%～75%患者確診時(shí)已處于中晚期，喪失了早期手術(shù)切除機(jī)會(huì)，放化療是主要的臨床治療方案。常規(guī)分割放療主張單次小劑量、增加放療次數(shù)，雖然提高了放療安全性，在放療間歇期增加了腫瘤細(xì)胞再氧合、細(xì)胞周期再分布，也提高了下一次分割照射的敏感性〔1〕，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)更多的腫瘤細(xì)胞存活，增殖加快，導(dǎo)致再群體化，增加了放射抵抗性〔2〕。也有研究指出〔3〕，放療本身作為一種應(yīng)激源，對(duì)腫瘤群體起到篩選作用，使原本不耐受放療的腫瘤細(xì)胞死亡，而放療耐受的細(xì)胞存活下來(lái)繼續(xù)增殖和轉(zhuǎn)移。大分割適形放療通過(guò)提高單次放療劑量和縮短放療次數(shù)，較常規(guī)放療提高了腫瘤細(xì)胞殺傷力度，縮短了整體治療療程，有效控制局部病灶，抑制腫瘤細(xì)胞的存活和再增殖活性，減少了放療抵抗，提高了患者存活率〔4〕。放療抵抗的產(chǎn)生導(dǎo)致放療失敗，患者臨床預(yù)后變差。放療抵抗的產(chǎn)生是多基因、多因子和多機(jī)制共同參與的病理生理過(guò)程，與放療方案、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)信號(hào)通路活化程度、腫瘤干細(xì)胞的產(chǎn)生、多種微小RNA(microRNAs)的表達(dá)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(HGFR)活性〔5～7〕等密切相關(guān)。本研究主要探討大分割適形放療在晚期NSCLC患者中的應(yīng)用及放療抵抗發(fā)生與血清miR-123和HGFR表達(dá)的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象資料 回顧性總結(jié)2015年1月至2017年12月中國(guó)科學(xué)院合肥腫瘤醫(yī)院及北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院確診晚期NSCLC患者86例臨床資料，納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)影像學(xué)或CT引導(dǎo)腫瘤穿刺或支氣管鏡細(xì)胞活檢病理確診NSCLC；②TNM分期Ⅲb～Ⅳ期；③Karnofsky功能狀態(tài)(KPS)評(píng)分≥75分；④接受單純的大分割適形放療；⑤堅(jiān)持完成規(guī)定療程，取得知情同意，臨床資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在放療禁忌；②應(yīng)用化療、生物治療；③嚴(yán)重肝腎功能障礙。86例患者中男50例，女36例，年齡58～79〔平均(65.5±7.8)〕歲，體重指數(shù)(BMI)22.5～26.5〔平均(24.5±2.3)〕kg/m2，Ⅲb期62例，Ⅳ期24例，原發(fā)腫瘤最大直徑2.5～5.6〔平均(3.9±1.1)〕cm。

1.2放療方法 入院完善相關(guān)檢查，評(píng)估疾病嚴(yán)重程度和放療風(fēng)險(xiǎn)，大分割適形放療具體方案為仰臥位，醫(yī)科達(dá)公司(Electa)6D-Axesse高能直線加速器；壓力傳感器，定位體框架，真空負(fù)壓墊體位固定，Philips Brilliance CT Big Bore完成4DCT平掃+常規(guī)增強(qiáng)，對(duì)治療靶區(qū)與危及器官進(jìn)行勾畫，確定內(nèi)大體腫瘤體積(IGTV)、內(nèi)臨床靶區(qū)(ICTV)、計(jì)劃靶區(qū)(PTV)；95%等劑量曲線對(duì)計(jì)劃靶體積環(huán)繞，設(shè)定容積調(diào)強(qiáng)放療(VMAT)單弧或者雙弧旋轉(zhuǎn)照射。處方劑量DT：3.5～6.0 Gy/次，5次/w，總劑量48～60 Gy，共2～3 w，同時(shí)對(duì)危及器官進(jìn)行限量，注意對(duì)放療區(qū)域外的器官進(jìn)行保護(hù)，放療間隙期加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)支持，密切監(jiān)測(cè)各項(xiàng)生命體征和血生化，對(duì)不適反應(yīng)進(jìn)行對(duì)癥處理。

1.3研究方法 放療結(jié)束后1個(gè)月評(píng)估臨床療效，入組患者至少存在一個(gè)可測(cè)量體積的原發(fā)腫瘤病灶，臨床療效參照實(shí)體瘤標(biāo)準(zhǔn)〔8〕分為顯效、有效、穩(wěn)定和無(wú)效，其中顯效為腫瘤體積較基線水平至少縮小70%，無(wú)明顯并發(fā)癥，至少穩(wěn)定1個(gè)月不復(fù)發(fā)；有效為腫瘤體積縮小40%～69%，至少穩(wěn)定1個(gè)月不復(fù)發(fā)；穩(wěn)定為腫瘤體積縮小≤39%，無(wú)新發(fā)腫瘤病灶；無(wú)效為腫瘤體積較前增加，或出現(xiàn)新發(fā)腫瘤病灶，或出現(xiàn)嚴(yán)重放療并發(fā)癥，需要終止治療。將顯效和有效定義為放療敏感，穩(wěn)定和無(wú)效定義為放療抵抗。采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)血清miR-123水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清HGFR水平。采集患者清晨空腹肘靜脈血10 ml，2 500 r/min離心15 min取上層血清，分裝2只EP管中，-80℃保存待檢，一支用于miR-123檢測(cè)，一支用于HGFR檢測(cè)。ELISA試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，嚴(yán)格按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行。

1.4RT-PCR主要步驟 在裝有兩組樣品試管中加入等體積萃取試劑Trizol，根據(jù)提示一步法提取完整細(xì)胞中RNA，減少RNA變性損失；然后測(cè)定其濃度和純度，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒提示合成cDNA；設(shè)計(jì)引物序列，miR-123：正義鏈5′-GGTTTCATCCAGGATCGAGCAGG-3′，反義鏈5′-ACAAAGATGGTCACGGTCTGCC-3′，445 bp；內(nèi)參GAPDH：正義鏈5′-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3′，反義鏈：5′-GCACTGTGTTGGCGTACAGG-3′，225 bp。反應(yīng)體系為cDNA 2 μl+上下引物各 3 μl+Taq 聚合酶0.5 μl，加無(wú)菌反應(yīng)水至總體積為25 μl，反應(yīng)條件為95℃ 5 min，(95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 60 s)×30個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min結(jié)束。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，數(shù)碼照相行灰度值分析，結(jié)果以目標(biāo)引物與內(nèi)參引物的灰度比值表示。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1放療抵抗的發(fā)生 86例患者均順利完成放療，療效評(píng)估中顯效39例，有效21例，穩(wěn)定15例，無(wú)效11例，60例表現(xiàn)放療敏感，26例表現(xiàn)抵抗；兩組臨床資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 放療敏感組和抵抗組臨床資料比較

2.2兩組血清miR-123水平的比較 敏感組放療前和放療后1個(gè)月血清miR-123水平明顯低于抵抗組同時(shí)點(diǎn)(P<0.05)，敏感組放療后明顯低于放療前(P<0.05)，但抵抗組放療后與放療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組血清miR-123水平的比較

2.3兩組血清HGFR水平比較 敏感組放療前和放療后1個(gè)月血清HGFR水平明顯低于抵抗組同時(shí)點(diǎn)(P<0.05)，敏感組放療后明顯低于放療前(P<0.05)，但抵抗組放療后與放療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組血清HGFR水平的比較

3 討 論

腫瘤均會(huì)對(duì)放療產(chǎn)生一定的抵抗，不同的腫瘤對(duì)不同的放療方案產(chǎn)生抵抗率不同，這是目前臨床研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)〔9〕。關(guān)于放療產(chǎn)生的機(jī)制學(xué)說(shuō)也有多種，認(rèn)為與亞致死性損傷和再修復(fù)、細(xì)胞再增殖、細(xì)胞周期再分布和再氧和、微環(huán)境改變和乏氧細(xì)胞成分等有關(guān)〔10〕。放療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，存活細(xì)胞和即將死亡細(xì)胞及周圍組織間質(zhì)之間存在廣泛的聯(lián)系，經(jīng)多種細(xì)胞因子、激素和生長(zhǎng)因子進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞基因的表達(dá)，最終產(chǎn)生放療抵抗〔11〕。

本研究結(jié)果提示，晚期NSCLC患者經(jīng)大分割適形放療后產(chǎn)生抵抗率為30.2%。但是不同的研究對(duì)放療抵抗的定義不同，導(dǎo)致不同研究結(jié)果差異較大。目前對(duì)放療抵抗的定義也沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究著眼于臨床實(shí)際，采用放療后1個(gè)月腫瘤體積的變化區(qū)分放療效果，有一定的參考意義。本研究中放療敏感組與抵抗組患者的性別、年齡、BMI、腫瘤分期、最大直徑、病理分型和組織分化程度比較均無(wú)差異，提示患者和腫瘤的一般特征對(duì)預(yù)測(cè)放療抵抗風(fēng)險(xiǎn)可能價(jià)值不大。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，敏感組放療前和放療后1個(gè)月血清miR-123和HGFR水平明顯低于抵抗組，敏感組放療后明顯低于放療前，但抵抗組放療后與放療前比較差異不明顯，提示血清miR-123和HGFR水平上調(diào)可能預(yù)示放療抵抗的風(fēng)險(xiǎn)增加。

miR-123是一類19～25個(gè)核苷酸組成的小單鏈內(nèi)源性非編碼RNA，主要生物學(xué)功能是與特定mRNA結(jié)合，阻斷效應(yīng)蛋白編碼基因的表達(dá)，激活致癌通路、抑制抑癌基因活性、誘導(dǎo)相關(guān)腫瘤蛋白的表達(dá)來(lái)參與放療抵抗〔12〕。體外肺癌A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)〔13〕，放射敏感細(xì)胞群中miR-123表達(dá)水平明顯高于抵抗細(xì)胞群，考慮與miR-123增加了放療過(guò)程中腫瘤細(xì)胞阻滯于G1期，誘導(dǎo)更多細(xì)胞凋亡有關(guān)。miR-123也表現(xiàn)抑癌效應(yīng)，調(diào)節(jié)神經(jīng)纖毛蛋白(NRP)-1表達(dá)活性增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞的放射敏感性〔14〕。miR-123還能夠抑制HGF/c-Met信號(hào)通路活性，誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡，降低放療抵抗〔15〕。HGFR能夠與HGF特異性結(jié)合，HGF/c-Met是由c-Met原癌基因編碼的跨膜酪氨酸激酶受體，是腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中重要的信號(hào)通路〔16〕。約40%以上NSCLC組織中c-Met呈陽(yáng)性表達(dá)，c-Met陽(yáng)性往往預(yù)示NSCLC患者臨床預(yù)后較差〔17〕。HGFR表達(dá)上調(diào)提示HGF/c-Met信號(hào)通路活性增強(qiáng)，對(duì)放療抵抗風(fēng)險(xiǎn)增加，內(nèi)在機(jī)制與放療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA損傷，激活DNA損傷修復(fù)，介導(dǎo)活化核因子(NF)-κB激活c-Met基因轉(zhuǎn)錄和HGF/c-Met信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲性，抑制細(xì)胞凋亡，增加放療抵抗性〔18〕。此外，PI3K/AKT信號(hào)通路也參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，與腫瘤的放療抵抗機(jī)制有關(guān)。PI3K/AKT信號(hào)通路激活后可以抑制DNA雙鏈斷裂的主要修復(fù)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)放射增敏作用；還可以作用于周期素D依賴蛋白激酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)化，參與腫瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期分布，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路使細(xì)胞阻滯于G1期，防止放射治療的再群體化，從而提高放療敏感性〔19〕。研究證實(shí)〔20〕，mTOR抑制劑能夠有效抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活性，提高放療敏感性。腫瘤干細(xì)胞的存在也是放療抵抗的一個(gè)重要機(jī)制，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞中具有干細(xì)胞特性的異質(zhì)性細(xì)胞，具有自我更新、多項(xiàng)分化潛能和不對(duì)稱分裂等功能，盡管數(shù)量只占腫瘤組織1%左右，但在腫瘤侵襲、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用〔21〕。腫瘤干細(xì)胞具有明顯的放療抵抗效應(yīng)，促進(jìn)DNA損傷修復(fù)、降低和清除活性氧、改變腫瘤微環(huán)境等多種途徑來(lái)逃避放療的殺傷作用。放療后即使殘留數(shù)量極少的腫瘤干細(xì)胞也能在放療間隙期大量增殖，造成腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生放療抵抗〔22〕。

綜上所述，盡管大分割適形放療在晚期NSCLC患者中有較好的安全性和有效性，但仍有一定的放療抵抗發(fā)生，可能與機(jī)體表達(dá)較高水平的miR-123和HGFR密切相關(guān)。研究不足是未能進(jìn)一步闡述放療抵抗與miR-123和HGFR表達(dá)之間的內(nèi)在聯(lián)系，以及miR-123和HGFR之間是否也存在緊密聯(lián)系，miR-123和HGFR是否能作為增加放療敏感性的干預(yù)靶點(diǎn)還需要進(jìn)行深入探討。