蜜橘酸腐病病原菌的分離鑒定以及不同抑菌劑處理對(duì)其控制效果

趙一潔，唐 毅，王威浩，姚世響，鄧麗莉,2，曾凱芳,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

蜜橘酸腐病病原菌的分離鑒定以及不同抑菌劑處理對(duì)其控制效果

趙一潔1，唐 毅1，王威浩1，姚世響1，鄧麗莉1,2，曾凱芳1,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

為確定蜜橘果實(shí)酸腐病的致病菌及膜醭畢赤酵母、水楊酸和殼寡糖對(duì)蜜橘果實(shí)采后酸腐病的控制效果，從自然發(fā)病的蜜橘果實(shí)上分離出一株致病真菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征、rDNA-ITS分析以及致病性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該真菌為蜜橘白地霉（Geotrichum candidum）。離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2.5 mmol/L水楊酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%殼寡糖處理能夠抑制白地霉孢子萌發(fā)和菌絲的生長(zhǎng)，膜醭畢赤酵母產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能夠抑制白地霉菌絲的生長(zhǎng)。果實(shí)上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，

蜜橘；酸腐?。荒钞叧嘟湍?；水楊酸；殼寡糖

蜜橘（Citrus unshiu Marc.）是中國(guó)、韓國(guó)和日本等亞洲地區(qū)最重要的柑橘品種之一。因其成熟期較集中，易造成市場(chǎng)供大于求，因此對(duì)其進(jìn)行采后貯藏十分必要[1]。但是蜜橘在貯藏期間容易受到病原菌的侵染而造成大量的腐爛，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在貯藏前期的病害主要是青霉?。≒enicillium italicum）、綠霉病（Penicillium digitatum），貯藏后期主要的病害是酸腐?。℅eotrichum citriaurentii）和炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides）[2]。近年來(lái)，蜜橘酸腐病已經(jīng)成為采后果實(shí)較難防治的病害之一，且不能被咪鮮胺、苯并咪唑類(lèi)等傳統(tǒng)殺菌劑所抑制[3]，因此尋找有效控制蜜橘采后酸腐病的方法已經(jīng)迫在眉睫。

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越重視食品安全問(wèn)題，尋找安全的抑菌劑十分必要，其中拮抗酵母和環(huán)境友好型的天然誘抗劑已經(jīng)被廣泛被用于果實(shí)采后病害的控制。膜醭畢赤酵母（Pichia membranaefaciens）屬于畢赤酵母屬（Pichia），可以與病原菌競(jìng)爭(zhēng)生存空間，可以寄生在病原菌的菌絲上以抑制病原菌的生長(zhǎng)，還可以誘導(dǎo)果實(shí)的抗病性以防治果實(shí)的采后病害[4]。研究表明，膜醭畢赤酵母能有效控制由Alternaria alternate、Penicillium expansum、Botrytis cinerea、Rhizopus stolonifer、Penicillium digitatum和Penilliun italicum引起的甜櫻桃、桃、油桃、枇杷、蘋(píng)果、蜜橘等果實(shí)的采后病害[5-8]。張璐等[9]研究結(jié)果表明，膜醭畢赤酵母能夠抑制草莓的灰霉病，延長(zhǎng)草莓的貯藏期。水楊酸（salicylic acid）作為一種天然抗菌物質(zhì)，具有對(duì)多種細(xì)菌和真菌的直接抑制作用。Neto等[10]研究結(jié)果表明，2.5 mmol/L水楊酸能夠100%抑制蘋(píng)果擴(kuò)展青霉孢子的萌發(fā)。殼寡糖（chitosan oligosaccharide）是經(jīng)蝦、蟹、貝類(lèi)的外殼降解而成的脫乙酰幾丁寡糖[11]。研究表明殼寡糖對(duì)多種植物真菌、細(xì)菌、病毒都有良好的抑制效果。Xu Junguang等[12]的研究表明，殼寡糖不僅能夠抑制辣椒疫霉菌的菌絲生長(zhǎng)，而且還能抑制其孢子的萌發(fā)；王麗等[13]研究結(jié)果表明，使用0.5 mg/mL的殼寡糖能夠抑制蜜橘酸腐病孢子的萌發(fā)和芽管的生長(zhǎng)；Ma Zengxin等[14]發(fā)現(xiàn)0.5 g/L的殼寡糖能夠防治采后桃果實(shí)的褐腐病，延長(zhǎng)桃果實(shí)的貯藏期。

膜醭畢赤酵母、水楊酸和殼寡糖均是天然的抗菌物質(zhì)，無(wú)毒無(wú)害，不會(huì)危害環(huán)境和人類(lèi)健康。研究發(fā)現(xiàn)這3 種抑菌物質(zhì)對(duì)柑橘青霉病、綠霉病、炭疽病等均有很好的抑菌效果，但其對(duì)酸腐病鮮見(jiàn)系統(tǒng)的研究。根據(jù)文獻(xiàn)[9-11]和本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)1×108CFU/mL酵母、2.5 mmol/L水楊酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%殼寡糖抗菌效果最好。本研究利用組織塊分離法在蜜橘病果上篩選出酸腐病的病原真菌，采用形態(tài)學(xué)特征、rDNA-ITS（internal transcribed spaer，內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）分析以及致病性檢測(cè)對(duì)所分離的菌株進(jìn)行鑒定，并利用膜醭畢赤酵母、水楊酸、殼寡糖對(duì)白地霉進(jìn)行離體實(shí)驗(yàn)和果實(shí)實(shí)驗(yàn)，探討膜醭畢赤酵母、水楊酸、殼寡糖對(duì)白地霉的抑制作用和對(duì)蜜橘酸腐病的控制效果，以期為蜜橘果實(shí)采后酸腐病的防治提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜜橘可溶性固形物含量為（8.77±0.15）%，可滴定酸含量為（1.01±0.05）%，產(chǎn)地為重慶雞公山，大小均一、成熟度一致、無(wú)機(jī)械傷。采摘后于實(shí)驗(yàn)室冷庫(kù)7～10 ℃貯藏備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)用2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min，后用自來(lái)水清洗并晾干。

膜醭畢赤酵母 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；水楊酸 成都市科龍化工試劑廠；殼寡糖 濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司；白地霉分離自蜜橘果實(shí)病健交界處。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰有限公司；B203生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；PowerPac電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；G:BOX EF凝膠成像儀 英國(guó)Syngene公司。

1.3 方法

1.3.1 膜醭畢赤酵母菌的制備

膜醭畢赤酵母懸浮液制作：1）活化菌種：在NYDA酵母培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)， 28 ℃條件下培養(yǎng)48 h；2）液體培養(yǎng)：挑取一環(huán)NYDA培養(yǎng)基上的酵母于NYDB液體培養(yǎng)基中，在200 r/min、28 ℃搖床中培養(yǎng)24 h；3）離心濃縮：5 000 r/min、4 ℃離心10 min，用無(wú)菌水洗滌2次，去培養(yǎng)基；4）血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后用無(wú)菌水稀釋至1×108CFU/mL備用。

1.3.2 水楊酸和殼寡糖溶液的制備

水楊酸為分析純?cè)噭褂脮r(shí)用無(wú)菌水配制，濃度為2.5 mmol/L。殼寡糖為分析純?cè)噭?，相?duì)分子質(zhì)量為1 500～2 000，使用時(shí)用無(wú)菌水配制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%。

1.3.3 蜜橘白地霉的分離與鑒定

1.3.3.1 組織塊分離法分離純化病原菌

參照劉霞[15]的方法，略有修改，選取已發(fā)病的蜜橘果實(shí)，利用75%乙醇進(jìn)行消毒滅菌30 s，取病健交界處組織小方塊（5 mm×5 mm），無(wú)菌水沖洗組織小方塊3 次，放置于滅菌冷卻的PDA平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱（相對(duì)濕度95%、28 ℃）內(nèi)培養(yǎng)3～5 d，待菌落形成后進(jìn)行單孢培養(yǎng)，獲取純化的病原菌。

1.3.3.2 蜜橘白地霉形態(tài)學(xué)鑒定

將濃度為的1×106CFU/mL孢子懸浮液加在含有PDA培養(yǎng)基載玻片上，進(jìn)行載玻片培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h在光學(xué)顯微鏡觀察分生孢子形態(tài)、菌絲形態(tài)并拍照；將濃度為的1×106CFU/mL孢子懸浮液加在平板中央，28 ℃條件下倒置培養(yǎng)。觀察并記錄菌落形態(tài)并拍照。

1.3.3.3 蜜橘白地霉DNA的提取

參照易潤(rùn)華等[16]的方法，略做修改，對(duì)病原菌的DNA進(jìn)行提取。稱(chēng)取0.5 g的病原菌菌絲，加入液氮快速充分研磨，研磨后移入1.5 mL的離心管中，加入600 μL 2×十六烷基三甲基溴化銨提取緩沖液（0.7 mol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20 mmol/L乙二胺四乙酸、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮、20 g/L十六烷基三甲基溴化銨，體積分?jǐn)?shù)0.1% β-巰基乙醇），在恒溫水浴鍋于65 ℃條件下保溫30 min，加等體積氯仿與異戊醇混合液（V（氯仿）∶V（異戊醇）= 24∶1）充分搖勻，4 ℃條件下8 000 r/min離心5 min。移取上清液至新的離心管中，加10%體積的3 mol/L醋酸鈉溶液（pH 6.0）和2.5 倍體積的冰凍乙醇，沉淀，4 ℃條件下8 000 r/min離心5 min，棄上清液，用75%乙醇洗2～3 次，晾干，加Tris-乙二胺四乙酸緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸pH 8.0）充分溶解后在-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.4 蜜橘白地霉DNA的鑒定

將提取的DNA低溫保存，送至生工生物工程(上海)股份有限公司，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增和測(cè)序，然后進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，根據(jù)序列同源性大小，確定該病原菌種類(lèi)。

1.3.3.5 致病性實(shí)驗(yàn)

將分離純化的病原菌，置于恒溫培養(yǎng)箱（相對(duì)濕度95%、28 ℃）內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)7 d，獲取濃度為1×104CFU/mL病原菌孢子懸浮液。選取健康無(wú)機(jī)械損傷、大小均勻的蜜橘果實(shí)，赤道部位損傷接種20 μL孢子懸浮液，用聚乙烯袋包裝保濕，放置28 ℃貯藏室，觀察果實(shí)的發(fā)病癥狀。

1.3.4 水楊酸、殼寡糖對(duì)蜜橘白地霉孢子萌發(fā)抑制效果的測(cè)定

將水楊酸和殼寡糖添加至55 ℃ PDA培養(yǎng)基中搖勻，使其分別為2.5 mmol/L和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，以不添加介質(zhì)的培養(yǎng)基為對(duì)照。取滅菌的載玻片，放于含有介質(zhì)的PDA培養(yǎng)基中蘸一下，冷卻形成薄層后，去掉一面瓊脂培養(yǎng)基。用微量移液器移取10 μL蜜橘白地霉孢子懸浮液，滴在瓊脂平面中間部位，平放于培養(yǎng)皿內(nèi)的“U”形玻棒上，平皿底用無(wú)菌水吸水濾紙保濕，28 ℃保溫保濕培養(yǎng)。分別于4 h和24 h顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況，觀察多個(gè)視野，使計(jì)數(shù)孢子個(gè)數(shù)不少于150 個(gè)，重復(fù)3 次[17]。按式（1）計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.3.5 水楊酸、殼寡糖對(duì)蜜橘白地霉菌絲生長(zhǎng)抑制效果的測(cè)定

測(cè)定使用含毒介質(zhì)法[18]并改進(jìn)。將水楊酸和殼寡糖添加至55 ℃ PDA培養(yǎng)基中，搖勻，使其分別為2.5 mmol/L和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，以不添加介質(zhì)的培養(yǎng)基為對(duì)照。倒平板，每平板為15 mL，每處理3 個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)基冷卻凝固后，用滅菌的打孔器在已培養(yǎng)形成蜜橘白地霉菌落PDA平板上，取直徑為1 cm菌斑，接種于PDA上，將平皿倒置放于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。每隔24 h觀察菌絲生長(zhǎng)情況，并用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，記錄平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 膜醭畢赤酵母揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蜜橘白地霉菌絲生長(zhǎng)抑制效果的測(cè)定

采用雙皿對(duì)扣法[19]，測(cè)定膜醭畢赤酵母生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蜜橘白地霉菌絲生長(zhǎng)的影響。將100 μL 108CFU/mL膜醭畢赤酵母均勻涂抹在平板上。24 h后，在另一個(gè)PDA平板中央接種直徑為1 cm的蜜橘白地霉菌塊。將培養(yǎng)皿蓋去掉，皿底口對(duì)口扣在一起，涂抹酵母平板在下，接種菌塊的PDA平板在上，用封口膜封口。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，一個(gè)PDA平板上不涂抹膜醭畢赤酵母，而另一個(gè)PDA平板上接種蜜橘白地霉菌塊。于28 ℃條件下培養(yǎng)，每間隔24 h用十字交叉法測(cè)量蜜橘白地霉菌落直徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.7 同孔接種處理實(shí)驗(yàn)

蜜橘果實(shí)隨機(jī)分為4 組，每組5 個(gè)果實(shí)，重復(fù)3 次。果實(shí)表面赤道部位用75%酒精擦拭消毒后，用消毒后的打孔器在果實(shí)赤道部位等距離打2 個(gè)孔（直徑4 mm、深3 mm）。每個(gè)孔用微量移液槍接種20 μL處理液，4 組處理液分別如下：1）無(wú)菌水作為對(duì)照處理；2）2.5 mmol/L水楊酸溶液；3）1.5%殼寡糖溶液；4）1×108CFU/mL的膜醭畢赤酵母懸浮液。待處理液被果實(shí)充分吸收后用聚乙烯薄膜袋單果包裝蜜橘果實(shí)，放置于20 ℃、相對(duì)濕度90%的環(huán)境中4 h，然后在果實(shí)的同一個(gè)孔中分別接種20 μL、1×104CFU/mL的白地霉孢子懸浮液。待菌液吸收干凈后，再用聚乙烯薄膜袋單果包裝，于20 ℃、相對(duì)濕度90%的環(huán)境中貯藏。每間隔24 h統(tǒng)計(jì)果實(shí)的發(fā)病率和病斑直徑。發(fā)病率計(jì)算見(jiàn)式（2）。

1.3.8 異孔接種處理實(shí)驗(yàn)

接種4 組處理液方法同1.3.7節(jié)。果實(shí)在接種處理液24 h后，在果實(shí)原來(lái)的孔徑周?chē)? cm左右，再打一個(gè)新孔（直徑4 mm、深3 mm），在這個(gè)新孔中分別接種20 μL 1×104CFU/mL的白地霉孢子懸浮液。待菌液吸收干凈后，再用聚乙烯薄膜袋單果包裝，于20 ℃、相對(duì)濕度90%的環(huán)境中貯藏。每24 h統(tǒng)計(jì)果實(shí)的發(fā)病率和病斑直徑。每組5 個(gè)果實(shí)，重復(fù)3 次。按式（2）計(jì)算發(fā)病率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003軟件統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖；應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），利用鄧肯式多重比較對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

圖1 病原菌的形態(tài)特征Fig. 1 Phenotype characteristics of the pathogen

病原菌的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)如圖1所示。在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，菌落呈圓形，較薄，正面顏色為白色平坦，中心為臍狀突起，背面基質(zhì)無(wú)色，平均直徑達(dá)到70 mm以上，菌絲質(zhì)地為絨毛狀兼粉狀，放射線狀，邊緣色淺，清晰（圖1A、B）。孢子呈圓柱或長(zhǎng)筒形、橢圓形、兩端多圓形、少數(shù)平切；無(wú)色透明，單胞，有時(shí)成鏈狀連接（圖1C）。菌絲在生長(zhǎng)過(guò)程中，呈二叉分枝，有橫隔，菌絲無(wú)色（圖1D）。參考真菌鑒定手冊(cè)[20]，病原菌的形態(tài)鑒定為典型的地霉屬真菌的形態(tài)。

2.2 病原菌分子生物學(xué)鑒定

圖2 菌株ITS的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig. 2 PCR products of the ITS region of the pathogen

如圖2所示，以病原菌DNA作為模版，擴(kuò)增出約1 318 bp左右的DNA片段。病原菌株rDNA-ITS測(cè)定結(jié)果如圖3所示，測(cè)序結(jié)果表明該片段長(zhǎng)1 318 bp。該核苷酸序列提交到GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi. nlm.nih.gov/blast）通過(guò)BLAST程序?qū)Ρ确治龅弥Y(jié)果：該病原菌與已知的白地霉（Geotrichum candidum，AB000652.1）rDNA-ITS區(qū)域同源性為98%，根據(jù)該病原菌的形態(tài)學(xué)特征和分子鑒定結(jié)果，可以說(shuō)明此病原菌就是白地霉。

圖3 病原菌核苷酸序列Fig. 3 Nucleotide sequences of the pathogen

2.3 病原菌致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將蜜橘果實(shí)表面分離的病原菌回接到健康的蜜橘果實(shí)上，能夠引起蜜橘果實(shí)腐爛，果實(shí)3 d后發(fā)病，果實(shí)變軟，發(fā)病處呈水漬狀并果皮軟化，病斑呈規(guī)則圓形，病斑擴(kuò)展2 cm時(shí)，發(fā)病處凹陷，然后長(zhǎng)出白色霉層，最后整果腐爛，并流出酸臭的液體，此癥狀與田間酸腐病果實(shí)一致（圖4），到第8天時(shí)果實(shí)全部腐爛。從而進(jìn)一步證明此病原菌就是白地霉。

圖4 回接病原菌發(fā)?。ˋ）和自然發(fā)?。˙）癥狀Fig. 4 Incidence of sour rot caused by the pathogen inoculated on satsuma mandarin (A) and natural incidence of satsuma mandarin (B)

2.4 水楊酸、殼寡糖對(duì)蜜橘白地霉孢子萌發(fā)以及菌絲生長(zhǎng)的影響

圖5 水楊酸、殼寡糖對(duì)白地霉孢子萌發(fā)率（A）和菌絲生長(zhǎng)（B）的影響Fig. 5 Effect of salicylic acid and chitosan oligosaccharide treatment on the spore germination rate (A) and mycelium growth (B) of G. candidum

如圖5所示，白地霉孢子萌發(fā)率和菌落直徑均隨著時(shí)間的增加呈上升的趨勢(shì)。對(duì)孢子萌發(fā)率，在4 h時(shí)，3 個(gè)處理組間均有顯著性差異（P＜0.05），其中對(duì)照組的孢子萌發(fā)率分別為水楊酸處理組和殼寡糖處理組的1.5、3.1 倍。對(duì)菌落直徑，水楊酸處理和殼寡糖處理與對(duì)照有顯著性差異，且殼寡糖處理組的菌落直徑一直顯著低于水楊酸處理組，在第6天時(shí)，對(duì)照組的菌落直徑為水楊酸處理組和殼寡糖處理組的1.24、6.33 倍。綜上，水楊酸處理和殼寡糖處理能顯著抑制孢子萌發(fā)率和菌落直徑的上升（P＜0.05），其中殼寡糖處理組效果顯著優(yōu)于水楊酸處理組（P＜0.05）。

2.5 膜醭畢赤酵母揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蜜橘白地霉菌絲生長(zhǎng)的影響

圖6 膜醭畢赤酵母產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)白地霉菌絲生長(zhǎng)的抑制效果Fig. 6 Effect of volatile organic compounds produced by P. membranaefaciens on the mycelial growth of G. candidum

如圖6所示，白地霉菌落直徑隨著時(shí)間的延長(zhǎng)菌落直徑呈上升趨勢(shì)，其中酵母揮發(fā)性物質(zhì)能顯著降低白地霉菌落直徑的生長(zhǎng)（P＜0.05）。在接種膜醭畢赤酵母和蜜橘白地霉的對(duì)扣皿處理中，2 d后PDA平板上的蜜橘白地霉菌落直徑為（2.7±0.1） cm，而在僅接種蜜橘白地霉對(duì)扣皿處理中，白地霉菌落直徑達(dá)到（3.60±0.15） cm，2 種處理之間白地霉菌落直徑差異性達(dá)到顯著水平（P＜0.05）（圖7）。在接種膜醭畢赤酵母和白地霉的對(duì)扣皿處理中，2 種真菌在空間上是分離的，白地霉菌絲生長(zhǎng)受到抑制，說(shuō)明膜醭畢赤酵母在生長(zhǎng)時(shí)利用PDA中的養(yǎng)分產(chǎn)生了揮發(fā)性抗真菌物質(zhì)，從而抑制白地霉菌絲的生長(zhǎng)。

圖7 2 d膜醭畢赤酵母產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蜜橘白地霉菌絲生長(zhǎng)的影響Fig. 7 Effect of volatile organic compounds produced by P. membranaefaciens on the mycelial growth of G. candidum after 2 days of storage

2.6 膜醭畢赤酵母、水楊酸、殼寡糖同孔接種處理對(duì)蜜橘果實(shí)酸腐病的防治效果

圖8 膜醭畢赤酵母、水楊酸、殼寡糖與白地霉同孔接種處理對(duì)蜜橘果實(shí)酸腐病發(fā)病率（A）和病斑直徑（B）的影響Fig. 8 Effect of P. membranaefaciens, salicylic acid and chitosan oligosaccharide on disease incidence (A) and lesion diameter (B) of satsuma mandarin with G. candidum inoculation on the same wounds

如圖8所示，膜醭畢赤酵母、水楊酸、殼寡糖同孔接種處理的蜜橘果實(shí)在貯藏期間，果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。和對(duì)照相比，水楊酸處理組發(fā)病率和對(duì)照無(wú)顯著性差異，但能夠顯著抑制病斑直徑的擴(kuò)增。殼寡糖和膜醭畢赤酵母處理組均能顯著抑制蜜橘發(fā)病率和病斑直徑的增長(zhǎng)（P＜0.05），且膜醭畢赤酵母處理組效果最好，并與殼寡糖處理組有顯著性差異（P＜0.05）。在貯藏第8天，對(duì)照組果實(shí)發(fā)病率分別是殼寡糖處理組、膜醭畢赤酵母處理組的1.49、2.70 倍，對(duì)照果實(shí)病斑直徑分別是殼寡糖處理組、膜醭畢赤酵母處理組的1.29、3.64 倍。圖9直觀地表明在貯藏4、6、8 d同孔接種不同處理組之間病斑直徑的擴(kuò)展情況?？梢钥闯?，3 組處理均可以抑制酸腐病病斑直徑的擴(kuò)展，其中膜醭畢赤酵母處理效果最好。

圖9 水楊酸、殼寡糖和膜醭畢赤酵母與白地霉同孔接種處理后柑橘果實(shí)酸腐病的發(fā)病情況Fig. 9 Effect of salicylic acid, chitosan and P. membranaefaciens of satsuma mandarin with G. candidum inoculation on the same wounds after 4, 6 and 8 days of storage

2.7 膜醭畢赤酵母、水楊酸、殼寡糖異孔接種處理對(duì)蜜橘果實(shí)酸腐病的防治效果

圖10 膜醭畢赤酵母、水楊酸、殼寡糖與白地霉異孔接種處理對(duì)蜜橘果實(shí)酸腐病發(fā)病率（A）和病斑直徑（B）的影響Fig. 10 Effect of P. membranaefaciens, salicylic acid and chitosan oligosaccharide on disease incidence (A) and lesion diameter (B) of satsuma mandarin with G. candidum inoculation on different wounds

如圖10所示，膜醭畢赤酵母、水楊酸、殼寡糖異孔接種處理的蜜橘果實(shí)在貯藏期間，果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，和對(duì)照相比，3 種處理均能控制果實(shí)酸腐病的發(fā)病率和病斑直徑的增長(zhǎng)，且水楊酸處理組效果最好。水楊酸處理組能顯著降低果實(shí)酸腐病的發(fā)病率和病斑直徑（P＜0.05）。在貯藏第7天，對(duì)照組的發(fā)病率和病斑直徑分別是水楊酸處理組的1.37 倍和1.51倍。殼寡糖和酵母處理組發(fā)病率在前期均與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，到貯藏后期（第7天）其發(fā)病率與對(duì)照組有顯著性差異，且在整個(gè)貯藏過(guò)程中均能顯著抑制病斑直徑的生長(zhǎng)（P＜0.05）。在貯藏第7天，對(duì)照組果實(shí)發(fā)病率分別是殼寡糖處理組、膜醭畢赤酵母處理組的1.37、1.30倍，對(duì)照果實(shí)病斑直徑分別是殼寡糖處理組、膜醭畢赤酵母處理組的1.12、1.31倍。圖11直觀表明貯藏5、6、7 d異孔接種不同處理組之間病斑直徑的擴(kuò)展情況?？梢钥闯觯蛯?duì)照相比3 組處理均可以抑制酸腐病病斑直徑的擴(kuò)展，其中水楊酸處理效果最好。

圖11 水楊酸、殼寡糖和膜醭畢赤酵母與白地霉異孔接種處理后柑橘果實(shí)酸腐病的發(fā)病情況Fig. 11 Effect of salicylic acid, chitosan and P. membranaefaciens of satsuma mandarin with G. candidum inoculation on the different wounds after 5, 6 and 7 days of storage

3 討 論

采用組織分離法從發(fā)病蜜橘果實(shí)上分離酸腐病菌，并進(jìn)行致病性檢測(cè)。根據(jù)致病性測(cè)定結(jié)果、病原菌菌落形態(tài)、孢子和菌絲形態(tài)以及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果等鑒定蜜橘酸腐病菌為白地霉（Geotrichum candidum），與劉霞[15]、周海恩[21]和王哲[22]等的研究結(jié)果一致。同時(shí)，研究表明番茄、葡萄、桃子以及荔枝的酸腐病的病原菌也為白地霉[23-27]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)膜醭畢赤酵母在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能夠抑制蜜橘白地霉菌絲的生長(zhǎng)，程雷[28]研究發(fā)現(xiàn)畢赤類(lèi)酵母，季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）能夠抑制蘋(píng)果灰霉菌和青霉菌菌落的擴(kuò)展，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。目前報(bào)道的膜醭畢赤酵母抗病機(jī)制主要包括競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性[29-30]，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了膜醭畢赤酵母產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)同樣對(duì)蜜橘酸腐病有較好的抑制作用，也是其主要的控病機(jī)理。水楊酸對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌、白色假絲酵母有直接抑制作用[31]，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)2.5 mmol/L水楊酸能夠抑制蜜橘白地霉孢子的萌發(fā)和菌絲的生長(zhǎng)，說(shuō)明水楊酸對(duì)白地霉菌有直接抑制作用。王永博[32]發(fā)現(xiàn)水楊酸濃度在2～10 mmol/L時(shí)對(duì)黑斑病菌的抑制較為顯著，楊超[33]研究表明水楊酸處理對(duì)灰葡萄孢菌的菌落直徑和孢子萌發(fā)率均有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相一致。但王博宇等[34]發(fā)現(xiàn)0.025%～0.010%水楊酸對(duì)采后青椒黑斑病的孢子萌發(fā)和菌落擴(kuò)展均無(wú)明顯抑制作用，因水楊酸濃度與抑菌效果成正比[35-36]，所以可能與其濃度過(guò)低有關(guān)。

殼寡糖對(duì)果蔬采后病害控制機(jī)制最先表現(xiàn)為直接的抑菌作用。殼寡糖的抑菌活性與其能改變菌絲體生長(zhǎng)形態(tài)有關(guān)[37-40]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%殼寡糖能夠抑制蜜橘白地霉孢子的萌發(fā)和菌絲的生長(zhǎng)。祖慶勇等[41]研究發(fā)現(xiàn)高濃度的殼寡糖可以抑制交鏈孢菌菌絲的生長(zhǎng)；Yan Jiaqi等[42]研究發(fā)現(xiàn)0.5～20.0 g/L的殼寡糖能夠抑制棗黑霉病菌菌絲體的生長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致。但Molloy等[43]發(fā)現(xiàn)2 g/L殼寡糖對(duì)胡蘿卜核盤(pán)菌無(wú)生長(zhǎng)抑制作用?？赡芘c殼寡糖的抑菌活性一般具有濃度效應(yīng)有關(guān)，賈盼盼等[44]研究發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加，殼寡糖對(duì)病原菌的抑制作用增強(qiáng)；同時(shí)也有可能用為殼寡糖對(duì)不同的病原菌有不同的半致死濃度[45]，殼寡糖抑制梨黑斑病菌和輪紋病菌菌絲體生長(zhǎng)的半抑制濃度分別為1.46 g/L和0.35 g/L[46]。

本實(shí)驗(yàn)中，同孔損傷接種實(shí)驗(yàn)中膜醭畢赤酵母處理、水楊酸處理、殼寡糖處理均對(duì)蜜橘酸腐病有控制效果。其中膜醭畢赤酵母的效果最好，與Zhou Yahan等[47]研究結(jié)果一致，殼寡糖處理要優(yōu)于水楊酸處理，與阿衣木古麗·艾賽提[48]的研究一致?？赡芤?yàn)槟钞叧嘟湍笇?duì)蜜橘酸病的控制是多方面的有關(guān)，不僅能夠直接抑制病原菌生長(zhǎng)，也能通過(guò)營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng)，以及揮發(fā)性物質(zhì)直接抑制病原菌生長(zhǎng)。同時(shí)水楊酸和殼寡糖同孔處理效果與離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，可以得出同孔處理時(shí)水楊酸和殼寡糖可能主要通過(guò)直接抑制病原菌的生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，從而抑制酸腐病的發(fā)病。而異孔損傷接種實(shí)驗(yàn)中水楊酸的效果最好。因?yàn)樗畻钏崮茱@著提高果實(shí)體內(nèi)苯丙烷代謝相關(guān)酶的活性及果實(shí)總酚、類(lèi)黃酮和木質(zhì)素含量的積累[49-50]，從而提高果實(shí)誘導(dǎo)抗病性。而鄧雨艷等[51]研究殼寡糖處理果實(shí)后需要先激活水楊酸信號(hào)，從而產(chǎn)生誘導(dǎo)抗病性。所以水楊酸處理相對(duì)于殼寡糖處理更加直接，效果最好。

綜上所述，蜜橘酸腐病的病原菌為白地霉菌株，膜醭畢赤酵母、水楊酸、殼寡糖均對(duì)蜜橘酸腐病有顯著控制效果，直接抑菌病原菌及誘導(dǎo)寄主抗病性是其主要作用機(jī)制，其中膜醭畢赤酵母直接抑菌效果最好，而水楊酸可以顯著提高蜜橘的誘導(dǎo)抗病性，殼寡糖的直接抑制作用優(yōu)于提高蜜橘誘導(dǎo)抗病性，但其抗病效果并不明顯。本實(shí)驗(yàn)初步研究了膜醭畢赤酵母、水楊酸、殼寡糖的控病效果，下一步可對(duì)水楊酸和酵母進(jìn)行復(fù)合作用，或?qū)ζ錂C(jī)理進(jìn)行系統(tǒng)和深一步的研究；同時(shí)也可以研究其與不同拮抗劑復(fù)合，從而期待得到更好的效果，為蜜橘酸腐病的防治提供新的方法和思路。

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Isolation and Identif i cation of Sour Rot Pathogen of Satsuma Mandarin and Inhibitory Effects of Three Antifungal Substances on It

ZHAO Yijie1, TANG Yi1, WANG Weihao1, YAO Shixiang1, DENG Lili1,2, ZENG Kaifang1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Chongqing Engineering Research Center of Regional Food, Chongqing 400715, China)

This investigation aimed to identify the sour rot pathogen of satsuma mandarin and to test the effect of Pichia membranaefaciens, salicylic acid and chitosan oligosaccharide in controlling this pathogen. We isolated a fungal pathogen from naturally infected citrus fruits and identif i ed it as Geotrichum candidum on the basis of morphological characteristics, rDNA-ITS sequence analysis and pathogenicity. In addition, 2.5 mmol/L salicylic acid and 1.5% chitosan oligosaccharide could signif i cantly inhibit the germination and mycelial growth of G. candidum under detached conditions. The volatile substances of P. membranaefaciens could inhibit the mycelial growth of G. candidum. Similarly, 1 × 108CFU/mL P. membranaefaciens, 2.5 mmol/L salicylic acid and 1.5% chitosan oligosaccharide treatment of the same and different wounds could control sour rot incidence and lesion diameter, especially P. membranaefaciens and salicylic acid through inoculation on the same wounds and different wounds, respectively.

satsuma mandarin; sour rot; Pichia membranaefaciens; salicylic acid; chitosan oligosaccharide

10.7506/spkx1002-6630-201707037

S666.2

A

1002-6630（2017）07-0230-08

趙一潔, 唐毅, 王威浩, 等. 蜜橘酸腐病病原菌的分離鑒定以及不同抑菌劑處理對(duì)其控制效果[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(7): 230-237. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707037. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Yijie, TANG Yi, WANG Weihao, et al. Isolation and identif i cation of sour rot pathogen of satsuma mandarin and inhibitory effects of three antifungal substances on it[J]. Food Science, 2017, 38(7): 230-237. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201707037. http://www.spkx.net.cn

2016-07-26

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD16B07）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（XDJK2016E111）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271958）

趙一潔（1993—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏工程。E-mail：zhaoyijie1993@163.com

*通信作者：曾凱芳（1972—），女，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏工程。E-mail：zengkaifang@163.com

1×108CFU/mL膜醭畢赤酵母、2.5 mmol/L水楊酸、1.5%殼寡糖同孔接種和異孔接種處理均能夠有效抑制蜜橘果實(shí)酸腐病的發(fā)病率和病斑直徑的上升，其中同孔處理膜醭畢赤酵母效果最好，異孔處理水楊酸效果最好。