一種基于微電極的珊瑚共生體光補償點測定方法探討

楊清松， 張燕英， 張 穎， 周衛(wèi)國， 凌 娟， 林顯程， 盛華夏， 董俊德

(1. 中國科學院南海海洋研究所 中國科學院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室， 廣州 510301; 2. 中國科學院大學， 北京 100049; 3. 中國科學院海南熱帶海洋生物實驗站， 三亞 572000; 4. 廈門大學 海洋與地球學院 近海海洋環(huán)境科學國家重點實驗室， 廈門 361102)

造礁石珊瑚(Reef-building Coral)是珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中主要的造礁生物，是珊瑚礁立體框架結構的基礎。造礁石珊瑚是由珊瑚蟲和其中共生的蟲黃藻(zooxanthellae)、原生動物、真菌、細菌、古菌、病毒等組成的共生體[1]。蟲黃藻通過光合作用可以為珊瑚宿主提供有機碳源，是珊瑚重要的能量來源[2]。研究揭示珊瑚共生的蟲黃藻可以將其光合產能的87%～95%傳遞給珊瑚宿主，而來自蟲黃藻的能量占造礁石珊瑚宿主的能量可達90%[3]。

珊瑚共生體的光合相關參數可以反映珊瑚的生存狀態(tài)及能量平衡。光補償點(Light compensation point)指示的是光合生物在其光合速率與呼吸速率一致時的光合有效輻射(Photosynthetically active radiation，PAR)。理論上，珊瑚的光補償點的差異可以決定珊瑚生長對PAR的需求，影響珊瑚在珊瑚礁中棲居的水深范圍[4]。對于不同珊瑚物種，光補償點較高的珊瑚物種其需要維持呼吸代謝的PAR更高，不能生存在光照較弱的深水區(qū)域，反之光補償點較低的珊瑚物種更能夠適應深水區(qū)域較低的PAR。對于同種珊瑚，其光補償點較低時說明珊瑚共生體的呼吸代謝較弱，生存狀態(tài)較差；反之，如果珊瑚共生體的光補償點較高，則表明珊瑚的呼吸代謝旺盛，生存狀態(tài)良好。

由于珊瑚共生體中參與光合作用的蟲黃藻與珊瑚宿主及其他共生生物的復雜關系，珊瑚的光補償點可能會受多種因素的影響。影響和調節(jié)珊瑚共生體光補償點的機制有待深入研究。然而由于珊瑚共生體組成復雜，且棲居于水中，測定其光合參數的方法更為復雜，故而測定珊瑚共生體的光補償點的方法鮮有報道。微電極是可以用于精確測量珊瑚組織內包括pH值、溶氧、碳酸根、鈣離子等參數的強大工具[5-6]。本研究提出了一種使用溶氧微電極，依據擴散平衡理論[7]，對珊瑚共生體的光補償點進行直接測定的方法。

1 材料和方法

1.1 測定原理

珊瑚的組織和黏液表面與海水之間存在著溶氧濃度梯度層，稱之為擴散邊界層(Diffusive boundary layer)[8]。當珊瑚在光照充足的條件下時，珊瑚共生體內產生的氧氣大于自身呼吸所需的量，氧氣由珊瑚體內向外周海水擴散；反之，當光合作用產氧不足以支持呼吸耗氧時，氧氣由外周海水向珊瑚體內擴散，在擴散邊界層形成相反方向的氧氣擴散濃度梯度[9]。珊瑚的擴散邊界層的氧氣擴散符合Fick第一擴散定律[7]：

其中J為擴散流量，D為擴散常數，C為氣體濃度，x為擴散距離。

基于光補償點的定義，當施加的PAR等于光補償點時，珊瑚共生體達到光合產氧量與呼吸耗氧量平衡，與環(huán)境無氧交換。此時，對于珊瑚的擴散邊界層上任意位置x上的氧氣濃度C應與水體本底氧濃度相等，其氧氣擴散流量的凈值J應為0。因此，珊瑚擴散邊界層溶氧濃度與海水本底溶氧濃度相等時的PAR即為珊瑚的光補償點。通過調節(jié)PAR并監(jiān)測擴散邊界層溶氧濃度變化，建立PAR與溶氧濃度的關系式，將海水本底溶氧值代入關系式解出對應的PAR值即為珊瑚的光補償點。

1.2 珊瑚樣品準備

實驗采用的鹿角杯形珊瑚(Pocilloporadamicornis)樣品采集自三亞鹿回頭。潛水采集一株鹿角杯形珊瑚，珊瑚出水后將整株珊瑚分為多個珊瑚斷枝，并將珊瑚斷枝用阿隆發(fā)膠水粘結于陶瓷基座上，并置于實驗養(yǎng)殖棚下1 m3水族缸內暫養(yǎng)備用。

1.3 PAR和溶解氧測定

在實驗室內小水簇缸周圍組合溶氧微電極(Unisense)、照度計(Biospherical)、可調節(jié)光源(Nikon)，搭建珊瑚溶氧測定平臺(如圖1所示)。分別用氮氣和空氣曝氣的海水做參考品，通過零溶氧和飽和溶氧兩點繪制工作曲線以校正溶氧微電極。先將微電極置于遠離珊瑚的位置測定海水中的溶氧濃度。然后調整溶氧微電極尖至珊瑚杯口表面(在體視鏡下進行)，并觀測到溶氧濃度值的明顯變化，確認電極進入了珊瑚擴散邊界層。調整照度計至與電極水深相當的深度，并固定光源位置。將實驗平臺嚴格遮光，以防止外來光的影響。

首先觀測珊瑚擴散邊界層溶氧濃度對光照有無變化的響應，待溶氧微電極讀數穩(wěn)定后，關閉光源，待溶氧讀數降至最低點并穩(wěn)定時再打開光源，記錄溶氧變化。然后觀測擴散邊界層溶氧濃度與PAR之間的關系，調節(jié)PAR由高逐級降低，在每級光強停留1～2 min，待溶氧數值穩(wěn)定后調低PAR至一下級，將光照調至最低穩(wěn)定后，再逐漸調大PAR。電腦記錄整個過程的PAR與溶氧數據序列。

圖1 珊瑚光補償點測定平臺示意圖

1.4 光補償點計算

導出PAR與溶氧數據序列并對齊時間軸，得到光強與珊瑚擴散邊界層溶氧濃度的對應關系，確定珊瑚擴散邊界層在不同PAR下對應的穩(wěn)定溶氧濃度。分別計算在PAR增加與減弱過程中擴散邊界層溶氧濃度與PAR的相關性，得到PAR與溶氧的關系式。根據擴散邊界層溶氧濃度與PAR的關系式，計算出珊瑚的擴散邊界層溶氧濃度與水體溶氧濃度相等時的PAR即為珊瑚共生體光補償點。

2 結果

在測試珊瑚對光照有無變化的響應實驗中，關閉光源后，珊瑚的擴散邊界層的溶氧濃度急劇下降，并在60 s左右溶氧穩(wěn)定在接近0 μmol/L的水平(圖2)。結果表明，擴散邊界層的溶解氧濃度會快速響應輻照強度的變化，建立新的溶氧濃度梯度平衡。因此在調節(jié)輻照強度過程中，每個輻照強度持續(xù)時間1～2 min左右足以建立新的濃度梯度平衡。而從黑暗到恢復光照后，珊瑚擴散邊界層的溶解氧濃度升高，并在約120 s后達到新的平衡。光照從暗到明比從明到暗這一過程要花費更長的時間達到新的溶氧濃度梯度平衡。

圖2擴散邊界層溶氧濃度對光源有無的響應

在逐級調低PAR的過程中，珊瑚擴散邊界層溶氧濃度也隨之降低，且在每檔PAR下較快達到穩(wěn)定值(圖3)。在PAR由低升高的過程中觀測到的擴散邊界層溶氧濃度數值也隨之上升，但反應較為滯后，存在較大波動，難以進入穩(wěn)定狀態(tài)(圖3)。

圖3 珊瑚擴散邊界層溶氧濃度隨光照逐級調整而變化

為進一步分析擴散邊界層溶氧濃度與PAR之間的關系，分別對光照強度由高降低和由低升高兩個過程中的珊瑚擴散邊界層溶氧濃度與PAR進行相關性分析。結果表明，光照由強變弱過程的溶氧濃度與PAR值的相關性(R=0.996)高于光照由弱變強過程的溶氧濃度與PAR值的相關性(R=0.989)。根據兩種情況下溶氧濃度與PAR值的關系，計算珊瑚擴散邊界層溶氧濃度與海水中溶氧濃度(192.5 μmol/L)相等時的PAR值，得到鹿角杯形珊瑚的光補償點分別為1.52 μE/m2/s和1.67 μE/m2/s。鹿角杯形珊瑚的光補償點與三白草科喜陰植物的光補償點相當[10]。

圖4 光照由強變弱(A)和由弱變強(B)過程中珊瑚擴散邊界層溶氧濃度與PAR的關系

本實驗中PAR由弱變強的過程測得的光補償點(1.67 μE/m2/s)略高于PAR由強變弱的過程中測得的光補償點(1.52 μE/m2/s)。這可能與珊瑚的觸手對光的響應有關。鹿角杯形珊瑚的觸手上充滿了蟲黃藻。在PAR由弱變強的過程中，其觸手尚未完全舒展，因而其光照接受率低，達到同等的光合強度需要更高的PAR，從而測得的光補償點偏高。等待珊瑚的觸手舒展可能減少這一偏差，但會耗費更多的測定時間。加之PAR由強變弱過程中測得的珊瑚邊界層溶氧值與PAR的相關性更高。綜合分析，將PAR由強到弱調節(jié)過程中測得的光補償點數值可信度更高。

3 討論與結論

目前測定珊瑚光合參數的主要方法有密閉容器內的氧濃度變化監(jiān)測法、氧同位素膜進樣質譜法、溶氧微電極法、調制葉綠素熒光儀法(PAM)等[4]。因為PAM操作簡便，在野外和實驗室中的適用性強，目前在珊瑚光合參數測定中應用最為廣泛[11-13]。然而PAM測定的指標反映的是葉綠素的光合特性，而不能直接測定珊瑚的實時光合速率。實時光合速率測定方法的基本原理主要是對光合作用的底物與產物進行測定，即通過測定二氧化碳與氧氣的濃度變化來推測光合作用與呼吸作用的速率[14]。由于水體的緩沖作用，珊瑚共生體與周圍水體形成獨特的擴散梯度，使得珊瑚體內與周圍水體中的溶解氧濃度存在較大差異。且在密閉測量空間內消彌這一差異所花費的時間較長，使得測量具有一定的滯后性。利用微電極探針在珊瑚的表面直接測定溶解氧濃度，使得測定的實時性更高，可以更好地反映其瞬時光合呼吸狀態(tài)[15]。

本研究以鹿角杯形珊瑚為試驗對象，通過溶氧微電極探針測定珊瑚外周擴散邊界層的溶氧濃度對PAR變化的響應，進而測定珊瑚的光補償點。本方法適用于珊瑚等水生生物的光補償點的測定，由于其不受測定的水體緩沖效應的影響，能大大提高光補償點測定的準確性。鹿角杯形珊瑚為多水螅體珊瑚，各個水螅體之間的光合呼吸等生理過程可能存在細微差異，進一步的實驗分析評估這一潛在的差異十分必要。由于在開放空間進行測定，加之微電極的超高空間分辨率，使得本方法對單水螅體的珊瑚幼體等微小個體的單獨測定具有較好的適用性。這對研究造礁石珊瑚幼蟲幼體的光合特性具有重要價值。微電極溶解氧探頭具有體積小巧、測定區(qū)域精準、測定實時、精確度高的特點，在水生生物光合作用測定中具有很大的潛力和較高的應用價值[7, 16]。將來，在更多的珊瑚物種上進行的更多的重復實驗，可以進一步完善本方法。本研究提出了一種測定珊瑚共生體光合參數(光補償點)的新思路，但溶氧微電極法在珊瑚光合參數測定中的更多的應用有待進一步研究。