急性鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)暴露對(duì)黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)幼魚炎性反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

張木子， 袁莉霞， 黎 明， 王日昕

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)，雜食偏肉食性，在我國(guó)南方是一種非常重要的名優(yōu)經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類，其肌肉中富含人體所需的多種必需氨基酸，尤其是沒有肌間刺的優(yōu)點(diǎn)，深受廣大老百姓的喜愛。隨著市場(chǎng)需求量的不斷上漲，據(jù)《2017中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》[11]發(fā)布的權(quán)威數(shù)據(jù)顯示，截至2016年底，全國(guó)黃顙魚產(chǎn)量達(dá)到42萬t，業(yè)已成為我國(guó)重要淡水養(yǎng)殖種類之一。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，DEHP暴露能夠影響黃顙魚生長(zhǎng)、抗氧化、免疫力及抗病力，基于這個(gè)發(fā)現(xiàn)，本研究旨在評(píng)估急性DEHP暴露對(duì)黃顙魚炎性反應(yīng)相關(guān)基因(TNF、IFN和IL8)表達(dá)的影響，試圖查明炎性反應(yīng)與DEHP中毒之間可能的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖管理及取樣

黃顙魚幼魚購自浙江嘉興，毒性實(shí)驗(yàn)在寧波大學(xué)校內(nèi)基地進(jìn)行。暫養(yǎng)30 d后，挑選270尾體格健壯、大小均勻的魚苗(1.80±0.20)g，隨機(jī)分配到9個(gè)300 L塑料養(yǎng)殖桶中(每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù))，每桶30尾。基于自然水體中DEHP最低濃度0.1 mg/L，以及約9.5 mg/L DEHP半致死濃度[2，10]，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)DEHP處理組，分別為對(duì)照組(0 mg/L DEHP)、中濃度組(0.1 mg/L DEHP)和高濃度組(1 mg/L DEHP)，脅迫周期為96 h，期間停止投喂飼料。DEHP(Bellefonte, 美國(guó))原液在0.1 mg/L tween 80助溶劑中溶解后，進(jìn)一步稀釋到期望濃度。DEHP濃度的測(cè)定采用高效液相色譜法(HPLC)[12]。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，水溫26 ℃～28 ℃，溶氧(7.81±0.13)mg/L，亞硝酸鹽<0.5 mg/L，保持自然光照。

實(shí)驗(yàn)開始后，分別于0、12、24、48和96 h取樣，每次每桶隨機(jī)挑選3尾實(shí)驗(yàn)魚，MS-222麻醉后解剖獲取肝臟，液氮速凍，-80 ℃保存，備用。

1.2 基因mRNA表達(dá)量分析

黃顙魚肝臟的總RNA的提取采用RNAiso Plus試劑(TaKaRa，大連)，利用Prime ScriptTMPT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(SYBR Premix ExTaqII，TaKaRa，大連)，擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；40個(gè)循環(huán)包括95 ℃變性 20 s，57 ℃退火 25 s，72 ℃延伸 25 s。采用2-ΔΔCt法分析基因相對(duì)表達(dá)量[13]。

表1 黃顙魚炎性反應(yīng)相關(guān)基因和內(nèi)參基因RT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 DEHP不同暴露時(shí)間對(duì)TNF基因表達(dá)的影響

在96 h暴露過程中，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)魚肝臟中TNF基因表達(dá)量無顯著性變化(P>0.05)，見圖1；中、高濃度組實(shí)驗(yàn)魚肝臟中TNF基因表達(dá)量呈先升高后降低趨勢(shì)，表達(dá)量最高值分別出現(xiàn)在24和12 h(P<0.05)；DEHP暴露達(dá)12 h時(shí)，高濃度組實(shí)驗(yàn)魚肝臟中TNF基因表達(dá)量顯著最高，其次是中濃度組，而對(duì)照組TNF基因表達(dá)量最低(P<0.05)；暴露時(shí)間分別達(dá)24、48和96 h時(shí)，中濃度組實(shí)驗(yàn)魚肝臟中TNF基因表達(dá)量顯著高于高濃度組(P<0.05)。

2.2 DEHP不同暴露時(shí)間對(duì)INF基因表達(dá)的影響

在96 h暴露過程中，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)魚肝臟中IFN基因表達(dá)量無顯著性變化(P>0.05)，見圖2；中濃度組實(shí)驗(yàn)魚肝臟中IFN基因表達(dá)量呈先升高后降低趨勢(shì)，而高濃度組則呈逐漸降低趨勢(shì)(P<0.05)；暴露時(shí)間分別達(dá)12、24、48和96 h時(shí)，中濃度組實(shí)驗(yàn)魚肝臟中IFN基因表達(dá)量均顯著最高，其次是對(duì)照組，而高濃度組IFN基因表達(dá)量顯著最低(P<0.05)。

不同大寫字母(A、B、C)表示DEHP暴露濃度的影響存在差異性顯著; 不同小寫字母(a、b、c)表示DEHP暴露時(shí)間的影響存在差異性顯著(P<0.05)。下同

圖1 DEHP對(duì)黃顙魚肝臟TNF基因表達(dá)的影響

Figure 1 The effect of DEHP onTNFgene expression in liver of yellow catfish

圖2 DEHP對(duì)黃顙魚肝臟IFN基因表達(dá)的影響

2.3 DEHP不同暴露時(shí)間對(duì)IL8基因表達(dá)的影響

在96 h暴露過程中，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)魚肝臟中IL8基因表達(dá)量無顯著性變化(P>0.05)，見圖3；中、高濃度組實(shí)驗(yàn)魚肝臟中IL8基因表達(dá)量呈先升高后降低趨勢(shì)(P<0.05)；DEHP暴露達(dá)12 h時(shí)，中濃度組實(shí)驗(yàn)魚肝臟中IL8基因表達(dá)顯著最高，其次是高濃度組，而對(duì)照組IL8基因表達(dá)最低(P<0.05)；暴露時(shí)間分別達(dá)24、48和96 h時(shí)，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)魚肝臟中IL8基因表達(dá)量顯著最高，而中濃度組實(shí)驗(yàn)魚肝臟中IL8基因表達(dá)量顯著高于高濃度組(P<0.05)。

3 討論

在哺乳類，經(jīng)大量研究證實(shí)，鄰苯二甲酸酯類化合物(如DEHP)能夠激活炎性細(xì)胞中的細(xì)胞因子和炎性相關(guān)因子，加劇炎性反應(yīng)進(jìn)程，繼而對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)造成損傷[6]。王佳等[14]在人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株THP-1的研究中發(fā)現(xiàn)，1 μmol/LDEHP是通過誘導(dǎo)MMP-8、IL-1β等基因和蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧自由基(ROS)，從而激發(fā)炎癥反應(yīng)。Oh等[15]報(bào)道，100 μmol/L DEHP能使人HMC-1細(xì)胞系中炎癥性介質(zhì)IL-1β和COX-2的表達(dá)量顯著增加。但在低等動(dòng)物(包括魚類)中，DEHP暴露誘發(fā)炎癥反應(yīng)及免疫損傷的研究?jī)H見零星的報(bào)道。Lee等[16]報(bào)道，1 μmol/LDEHP暴露能夠顯著上調(diào)搖蚊(Chironomustentans)熱休克蛋白(HSP)基因和蛋白的表達(dá)量；Lu等[2]發(fā)現(xiàn)，0.2 μg/LDEHP暴露上調(diào)了菲律賓蛤仔免疫相關(guān)基因(如CypA-1和HSP90)的表達(dá)；Huang等[17]研究表明，青鳉魚(Oryziasmelastigma)暴露到1 mg/LDEHP中，肝臟中IL1β基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。腫瘤壞死因子是一類多功能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)接頭分子，由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在細(xì)胞內(nèi)能夠與下游信號(hào)分子相互作用，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，但過多的腫瘤壞死因子會(huì)造成組織損傷[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，中濃度的DEHP激活了實(shí)驗(yàn)魚肝臟中TNF的表達(dá)，但持續(xù)暴露達(dá)24 h后，TNF的表達(dá)量達(dá)到飽和。相比而言，高濃度DEHP暴露能夠在12 h內(nèi)迅速升高TNF的表達(dá)量，這種現(xiàn)象可能是由于高濃度的DEHP在短期內(nèi)引起“毒性興奮效應(yīng)”[19]造成的，但隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量逐漸降低到對(duì)照組之下。本研究提示，黃顙魚肝臟中TNF基因的表達(dá)與DEHP之間存在明顯的劑量依賴效應(yīng)，低濃度的DEHP能夠激活肝臟中TNF基因的表達(dá)，但DEHP暴露濃度超過生理耐受閾值時(shí)，其mRNA的表達(dá)量將受到顯著抑制。

圖3 DEHP對(duì)黃顙魚肝臟IL 8基因表達(dá)的影響

干擾素在機(jī)體應(yīng)答環(huán)境脅迫(如病毒感染)的過程中發(fā)揮重要作用。在哺乳類研究中已證實(shí)，IFN是典型的Th1分泌細(xì)胞因子，通過激活I(lǐng)L12刺激先天免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)對(duì)外源異物進(jìn)行清除[20]。黃貝等[21]報(bào)道，受到異源性抗原物質(zhì)刺激后，斑點(diǎn)叉尾鮰(Ietaluruspunetaus)、虹鱒和石斑魚(Epinepheluscoioides)血細(xì)胞中IFN基因的mRNA表達(dá)水平顯著提高。與上述報(bào)道相同，本研究發(fā)現(xiàn)，中濃度DEHP暴露顯著上調(diào)了黃顙魚肝臟中IFN基因的mRNA表達(dá)量。然而，高濃度的DEHP暴露卻抑制了實(shí)驗(yàn)魚肝臟中IFN的表達(dá)，INF的表達(dá)量在96 h毒性脅迫過程中持續(xù)下降。結(jié)果提示，低濃度DEHP暴露通過上調(diào)IFN的表達(dá)參與機(jī)體免疫應(yīng)答，但高濃度DEHP暴露則會(huì)對(duì)正常的生理活動(dòng)造成抑制。

在本研究中，與TNF和IFN基因的表達(dá)情況相比，實(shí)驗(yàn)魚肝臟中IL8基因的表達(dá)更易受到DEHP毒性的影響。DEHP暴露達(dá)12 h時(shí)，中、高濃度組實(shí)驗(yàn)魚肝臟中IL8基因的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，這種現(xiàn)象可能是一種機(jī)體自身的生理保護(hù)策略，以避免過度誘發(fā)細(xì)胞凋亡。龐雪利等[22]在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)基中IL 8含量的升高，能夠激活細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路，從而上調(diào)Bcl-2、下調(diào)caspase-3基因mRNA的表達(dá)量，達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的，并通過Western Blot做出進(jìn)一步的驗(yàn)證。Ghosh等[23]提出，短期高濃度DEHP暴露能夠減少NF-κB信號(hào)通路的活化，減少由于細(xì)胞凋亡過度激活對(duì)機(jī)體造成的傷害。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著DEHP暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，中、高濃度組實(shí)驗(yàn)魚肝臟中IL8基因的表達(dá)量均顯著下降，且低于對(duì)照組。結(jié)果提示，魚類能夠通過調(diào)控細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，在短期內(nèi)阻止DEHP對(duì)免疫系統(tǒng)造成的傷害，但這種防御機(jī)制受到生理耐受閾值的限制。

4 結(jié)論

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，黃顙魚肝臟中炎性反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)與DEHP之間存在明顯的劑量依賴效應(yīng)，低濃度的DEHP能夠激活炎性反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，而高濃度的DEHP暴露將抑制炎性反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)。