異葉天南星凝集素基因的克隆及蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)分析

李 晟， 趙德蕊， 張聲祥， 施圓圓， 楊青山,4， 王晨凱， 單春苗， 吳家文

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院, 合肥 230012； 2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院, 合肥 230012；3. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 合肥 230038；4. 安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心, 合肥 230012； 5. 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院, 合肥 230012)

異葉天南星(ArisaemaheterophyllumBlume)是一類重要的中草藥，它的塊莖在亞洲地區(qū)具有悠久的藥用歷史。其性溫，氣微辛，味辣，歸脾、肝、肺經(jīng)，主要用于燥濕化痰、祛風(fēng)定涼、消腫散結(jié)以及治療破傷風(fēng)、跌打損傷和毒蛇咬傷等[1]，同時還具有消炎、止痛和抗腫瘤的功效，在臨床上與其他中草藥配伍可有效治療肺癌、食管癌等疾病[2]。張志林等[3]已用MTT法證實(shí)天南星水提取物和乙醇提取物對體外宮頸癌Hela細(xì)胞、白血病K562細(xì)胞、胃癌BGC823細(xì)胞均有抑制增殖作用，且在動物試驗(yàn)中證實(shí)這些提取物對機(jī)體免疫系統(tǒng)沒有明顯影響。

凝集素(lectin)是一類在自然界中普遍存在的復(fù)雜非免疫球性蛋白或糖蛋白，現(xiàn)已從病毒、細(xì)菌、真菌、無脊椎動物、脊椎動物和植物中都分離出了凝集素[4-7]。凝集素在不同程度上參與了生物在正常和病理情況下的免疫過程。來源于植物或動物的凝集素作為一種潛在的治療藥物，由于其防御功能和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力被廣泛用于治療癌癥[8-9]。目前，植物凝集素已在多種不同的植物物種中被檢測到，并顯示具有特異性識別并可逆結(jié)合糖類復(fù)合物的糖基部分的特性[10]。凝集素專一性結(jié)合不同的糖分子，據(jù)此可將凝集素分為甘露糖結(jié)合凝集素、半乳糖結(jié)合凝集素、葡萄糖結(jié)合凝集素、巖藻糖結(jié)合凝集素和唾液酸結(jié)合凝集素等幾類[11]。本研究所克隆的AhLTN凝集素屬于D-甘露糖結(jié)合凝集素，此類凝集素只特異性結(jié)合含D型甘露糖的凝集素受體。伴刀豆凝集素A屬于D-甘露糖凝集素類別，其表達(dá)蛋白伴刀豆球蛋白(ConA)具有自噬型細(xì)胞毒性和免疫調(diào)節(jié)雙重功能，可加速小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞色素C的釋放和線粒體的聚集從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，也能誘導(dǎo)黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡[12-13]，在小鼠肝癌原位模型中，飼喂ConA后腫瘤組織發(fā)生了明顯的萎縮[14]。

自1982年Hoffman等[15]克隆出了第一個凝集素基因以來很多凝集素基因被成功克隆，例如凝集素基因已經(jīng)先后從苦參[16]、石斛[17-18]等中藥材中被成功克隆。本研究通過對異葉天南星轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得到Ahltn功能基因，通過RT-PCR等技術(shù)成功克隆出Ahltn的讀碼框序列片段，并進(jìn)一步利用生物信息學(xué)軟件對其表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)進(jìn)行了分析，以期為Ahltn基因和蛋白功能的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2018年3月于安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥園采摘異葉天南星植株并被安徽中醫(yī)藥大學(xué)楊青山老師鑒定。用超純水將異葉天南星多次漂洗至潔凈后用濾紙擦拭吸干表面水分，隨即將根、莖和葉分開采集后放入離心管冷凍于液氮中，最后放入-80℃冰箱凍存保留以用于RNA的提取。

1.2 儀器與試劑

主要儀器與試劑列于表1和表2。

表1 主要儀器

表2 主要試劑

1.3 總RNA的提取以及cDNA的合成

從-80℃冰箱中取出異葉天南星樣品加入液氮中充分研磨成粉末，利用E.Z.N.A Plant RNA Kit試劑盒純化獲得異葉天南星葉的總RNA，具體步驟如下(離心速度均為12 000 r/min)： 1)500 μL RB漂洗緩沖液與10 μL β-巰基乙醇混合。2)將凍存的新鮮葉片放入研缽中，加液氮，充分研磨成細(xì)粉，分裝入1.5 mL EP管中；加入準(zhǔn)備好的混合液，上下顛倒混合均勻，離心10 min。3)轉(zhuǎn)移上清約500 μL至DNA過濾柱中，離心2 min；加入1/2體積無水乙醇至流穿液中，上下顛倒5～10次。4)將液體轉(zhuǎn)移至純化柱中，離心10 min，棄濾液，將柱子放回收集管中；加入400 μL漂洗緩沖液，離心1 min，棄濾液和收集管。5)將純化柱放入2 mL新的收集管，加入漂洗緩沖液，離心1 min，棄濾液；重復(fù)本步驟一次。6)空管離心1 min，棄濾液和收集管；將純化柱轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中，加30～50 μL焦碳酸二乙酯 (DEPC) 洗脫RNA，靜置10 min，離心2 min獲得總RNA。

進(jìn)一步使用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證了RNA的濃度以及完整性，挑選優(yōu)質(zhì)的RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.4 引物設(shè)計(jì)

通過分析異葉天南星轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)，獲得其中的一個凝集素功能基因(基因編號為CL2833)，通過軟件分析獲得其ORF序列(命名為Ahltn)，使用Primer 5.0軟件在其ORF兩端設(shè)計(jì)一對特異性擴(kuò)增引物如下：Ahltn-S：5′-CATATGATGGCGGCAGCGAAGCCCGG-3′(26 bp)；Ahltn-A：5′-CTCGAGTCAGGCCCTGTTGCTCCCCGT-3′(27 bp)。

1.5 Ahltn基因的克隆

利用mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，采用兩步法對Ahltn基因進(jìn)行擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)體系為：2.5 μL 10×PCR緩沖液、16.0 μL 滅菌超純水、1.0 μL 10 mmol/L dNTP、1.0 μL 5 μmol/L上游及下游引物、2.0 μL cDNA、1.0 μL rTaqDNA聚合酶，共24.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，40 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共10個循環(huán)；隨后94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共25個循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。對RT-PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定以及膠回收試劑盒(AxyPrep)進(jìn)行膠回收，從而得到純化的目的基因Ahltn。

表3 生物信息學(xué)軟件

1.6 構(gòu)建克隆重組質(zhì)粒pMD19-T-Ahltn

將Ahltn基因與pMD19-T載體連接，連接體系為1.0 μL T4 DNA 連接酶、1.5 μL pMD19-T載體、11.0 μLAhltn基因、1.5 μL 10倍濃度連接酶緩沖液共15.0 μL。隨后將其混勻置入16 ℃水浴鍋中連接12 h。采用42 ℃熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h左右至培養(yǎng)基中長出菌斑，然后挑取平板上陽性克隆個體置入液體培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)，再收集菌體提取重組質(zhì)粒pMD19-T-Ahltn。最后選取PCR鑒定和雙酶切鑒定都正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定(上海生工生物工程公司)。

1.7 生物信息學(xué)分析

利用在線軟件對Ahltn的堿基序列及其編碼蛋白的理化性質(zhì)、同源性、進(jìn)化關(guān)系、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，具體見表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ahltn基因克隆和鑒定

2.1.1 總RNA的提取

通過紫外分光光度計(jì)測得異葉天南星總RNA的OD260/OD280比值為2.0，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)在28 S、18 S和5 S處分別有3條清晰可見的亮帶(圖1-A)，說明總RNA的濃度、純度和完整性均符合實(shí)驗(yàn)要求，可用于cDNA的合成。

2.1.2Ahltn基因的克隆

挑選高濃度的mRNA樣品為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。再以cDNA為模板，利用引物Ahltn-S和Ahltn-A進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在500～750 bp處發(fā)現(xiàn)一條清晰的基因條帶(圖1-B)。

2.1.3Ahltn克隆載體的構(gòu)建及鑒定

提純目的基因后將其連接到pMD19-T載體中，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR鑒定后(圖1-C)出現(xiàn)明確的目的條帶；重組質(zhì)粒經(jīng)生工測序所得序列與異葉天南星轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中CL2833基因序列一致，說明已成功克隆出Ahltn基因開放讀碼框，此序列已經(jīng)提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為MH729820。

A：總RNA提??；B：Ahltn基因克隆；C：菌液PCR鑒定；箭頭表示目的基因條帶

圖1Ahltn基因的克隆與鑒定

Figure 1 Cloning and identification ofAhltn

2.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.2.1Ahltn序列分析

用SMS在線軟件將Ahltn的cDNA序列翻譯成氨基酸序列(圖2)，Ahltn基因的讀碼框長度為561 bp，編碼186個氨基酸的蛋白質(zhì)，TGA為終止密碼子。

圖2 Ahltn的讀碼框序列和編碼的氨基酸序列

2.2.2Ahltn基因編碼蛋白的理化特性分析

Protparam 軟件分析顯示AhLTN蛋白質(zhì)分子不穩(wěn)定系數(shù)為22.39，低于閾值40，屬于穩(wěn)定型蛋白；其等電點(diǎn)為9.14，為偏堿性蛋白；總平均親水性指數(shù)為0.17，為疏水性蛋白。其他理化性質(zhì)列于表4。

2.2.3 AhLTN蛋白的基元分析

通過Motif Scan軟件分析，AhLTN含有多種基元，主要包含1個酰胺化位點(diǎn)、1個N-糖基化位點(diǎn)、4個酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)、5個蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、5個N-蛋白質(zhì)豆蔻?；稽c(diǎn)和1個C末端微體靶向序列(表5)，該蛋白屬于Bulb-lectin超家族。

表4 AhLTN的理化性質(zhì)

表5 AhLTN蛋白的基元或結(jié)構(gòu)域分析

2.2.4 AhLTN與不同物種凝集素蛋白的同源性比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

通過NCBI BLAST軟件對不同物種之間的凝集素蛋白序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明AhLTN與其他植物的凝集素蛋白有較高的序列同源性。如表6所示，AhLTN與鐵皮石斛(Dendrobiumcatenatum)、生姜(Zingiberofficinale)、郁金香雜交品種(Tulipahybridcultivar)和蔥蘭(Zephyranthescandida)等植物的凝集素蛋白序列同源性分別達(dá)到了70%、67%、64%和61%。在GenBank中獲取上述植物的凝集素蛋白序列后，由MEGA5.0軟件分析得到了AhLTN系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示。說明在現(xiàn)有的NCBI數(shù)據(jù)庫中AhLTN與鐵皮石斛(Dendrobiumcatenatum)凝集素遺傳距離最短，親緣關(guān)系最近。這與其門綱關(guān)系相符合,即AhLTN與鐵皮石斛同屬于被子植物門單子葉植物綱。

2.2.5 AhLTN蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

利用MEGA 5.0、Clustalx 1.83和ESPript 2.2軟件把AhLTN與表5中的11種不同植物中凝集素蛋白進(jìn)行了氨基酸序列比對(圖4)，并根據(jù)Swiss Model結(jié)構(gòu)模型分析AhLTN蛋白S37-T136部分的二級結(jié)構(gòu)(圖4，第一列)。結(jié)構(gòu)顯示AhLTN蛋白S37-T136區(qū)域具有11個β折疊結(jié)構(gòu)(S40-L42、Q45-Q49、Y52-Q57、C60-N66、V69-A73、V84-Q88、D92-F96、L103-S105、V117-Q121、N125-Y129、I133-A135)和9個TT結(jié)構(gòu)(S37-G38、T43-G44、G50-N51、E58-D59、G67-R68、Y77-H88、R89-D90、G98-S99、P122-D123)。3個甘露糖結(jié)合保守序列QXDXNXVXY(在圖4中用綠色三角形標(biāo)記)，分別位于Q57-Y65、Q86-F96、Q121-Y129，而Q86-F96序列中的D92和F96分別替換了保守序列中N和Y。

表6 AhLTN蛋白同源關(guān)系比對

圖3 AhLTN的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Figure 3 Phylogenetic tree of AhLTN

注：該進(jìn)化樹是利用MEGA5.0軟件生成，0.1代表遺傳距離

2.2.6 AhLTN蛋白三級和四級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線軟件Swiss Model[19-20]，以蛋白數(shù)據(jù)庫PDB(http://www.rcsb.org/)中的3a0c(PDB ID)的晶體結(jié)構(gòu)為模板得到了AhLTN的三級結(jié)構(gòu)模型，再使用PyMOL軟件繪制了AhLTN的三維立體結(jié)構(gòu)(圖5),AhLTN四級結(jié)構(gòu)是由兩個單體組成的同二聚體，兩個單體的C-末端的β-片層進(jìn)行了交換，增強(qiáng)了亞基間的結(jié)合力(圖5-A)。兩個亞基采用β-棱鏡II折疊方式形成[21]，各由3個亞結(jié)構(gòu)域組成(圖5-C)，其中每一個亞結(jié)構(gòu)域是由3～4個反平行的β-片層組成，構(gòu)成了三棱鏡的3個面，3個保守的色氨酸殘基Trp76，Trp108和Trp136分別位于3個面上，且將它們非極性的側(cè)鏈指向內(nèi)部，形成了棱鏡的疏水核心(圖5-B)。此外，三棱鏡每個面上都有糖基結(jié)合位點(diǎn)(CBS)，含保守的甘露糖結(jié)合基序QXDXNXVXY(其中X代表任何一種氨基酸殘基)，如圖5-C所示(兩個亞基的甘露糖結(jié)合位點(diǎn)分別用紅色或綠色示意)，這些結(jié)合位點(diǎn)在凝集素的碳水化合物識別過程中起著決定作用。

白底黑字表示不同的氨基酸；白底紅字表示相似的氨基酸；紅底白字表示相同的氨基酸；三角形表示甘露糖結(jié)合位點(diǎn)。AhLTN的二級結(jié)構(gòu)示意圖位于比對圖最上方，箭頭示意β-折疊

圖4不同物種間凝集素序列的比對及AhLTN的二級結(jié)構(gòu)示意圖

Figure 4 Comparation of lectins in different species and secondary structure of AhLTN

3 討論與結(jié)論

在此項(xiàng)研究中，我們首次成功克隆出異葉天南星的Ahltn基因的ORF片段，并利用了一系列生物信息學(xué)軟件對Ahltn基因編碼的蛋白性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。根據(jù)異葉天南星轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，該基因在根、莖和葉中表達(dá)值(FPKM)分別為0.3、0.16和0.06，其中在根中表達(dá)較多，但總體表達(dá)量都很低。Ahltn讀碼框編碼186個氨基酸。AhLTN的三級結(jié)構(gòu)富含β折疊，呈“三棱鏡”型，3個保守的色氨酸位于中心，構(gòu)成了疏水核心，并且三棱鏡每個面上所含的甘露糖結(jié)合位點(diǎn)決定了AhLTN與D-甘露糖獨(dú)特的結(jié)合性質(zhì)，而不同腫瘤細(xì)胞表面集中分布有不同的糖基，所以進(jìn)一步的研究應(yīng)集中在AhLTN基因編碼蛋白的表達(dá)與純化以及純化的蛋白對不同腫瘤細(xì)胞的影響。

A:AhLTN二聚體模型，藍(lán)色和紅色各示意一個單體；B:球形示意3個保守的色氨酸殘基Trp76、Trp108和Trp136；C:紅色或綠色示意2個亞基的甘露糖結(jié)合位點(diǎn)。AhLTN的三級結(jié)構(gòu)模板為3a0c，兩者的序列一致性為50.49%；序列相似性為42%；覆蓋率為55%(S35-G139)

圖5 AhLTN的同二聚體結(jié)構(gòu)模型

Figure 5 The structure model of AhLTN homodimer

近些年來，凝集素作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用前景受到人們的廣泛關(guān)注，它們獨(dú)特的糖結(jié)合性質(zhì)以及它們凝集細(xì)胞和沉淀多價碳水化合物的能力一直被人們挖掘，它們有望與癌細(xì)胞表面糖復(fù)合物結(jié)合而導(dǎo)致特定癌細(xì)胞的凋亡[18]，蓖麻毒蛋白是由A、B二條肽鏈構(gòu)成的典型的植物凝集素，其中B鏈與細(xì)胞表面的半乳糖結(jié)合后將A鏈釋放，A鏈進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與核糖體亞基中的RNA結(jié)合，致使細(xì)胞停止合成蛋白質(zhì)而死亡[22]。隨著腫瘤中日益增多的蓖麻毒蛋白結(jié)合位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，用天然未加修飾的凝集素來治療腫瘤已經(jīng)成為一種新的趨向。不同的凝集素分子與不同的糖基特異性結(jié)合，鮑錦庫[11]用7種不同的凝集素來分別標(biāo)記卵巢漿液囊腺瘤和漿液囊腺癌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有些凝集素特異性地與良性腫瘤細(xì)胞結(jié)合，而另外的一些只與惡性卵巢漿液囊腺癌細(xì)胞發(fā)生結(jié)合，這種現(xiàn)象說明由于惡性程度不同的卵巢上皮的糖復(fù)合物不同，導(dǎo)致凝集素在不同惡性程度腫瘤上的標(biāo)記也不同，所以用凝集素來鑒定腫瘤惡性程度是一個重要可行的方法。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，許多植物中的凝集素已經(jīng)可以在體外高效的表達(dá)和純化，并發(fā)展為腫瘤標(biāo)記物或抗腫瘤藥物。本研究將為天南星科凝集素開發(fā)為抗腫瘤臨床藥物或藥物載體奠定基礎(chǔ)。