返魂草顆?？寡趸课环治黾盎钚匝芯?/h1>
2019-12-19 02:07:54賈東旭周婷婷王春馳朱迪夫高其品
長春中醫(yī)藥大學學報 2019年6期
賈東旭，唐 燕，周婷婷，王春馳，高 娜，朱迪夫，高其品,3*
（1.吉林大學生命科學院，長春 130012；2.吉林省吉測檢測技術有限公司，長春 130117；3.長春中醫(yī)藥大學藥學院，長春 130117）
返魂草（senecionis cannabifolii herba, SCH）又名青菀、紫倩等，為菊科千里光屬多年生草本植物，主要分布在我國東北、西北和華北地區(qū)，具有抗病毒、抗菌、抗急性肺損傷、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、解熱抗胃潰瘍等活性，因此被廣泛應用于止咳平喘、肺部急性炎癥、慢性炎癥的治療，返魂草顆粒是由返魂草為原料經(jīng)水提得到的的單方制劑[1-3]；此外，祁海燕等[4]證明了以返魂草提取物為主要成分的返魂草顆粒（肺寧顆粒）可以上調(diào)AECOPD大鼠模型中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）水平，提示返魂草在抗氧化方面具有一定潛力，但目前對返魂草提取物中的抗氧化成分及其作用機制的研究還不深入。
酚酸（phenolic acids）是一類含有酚環(huán)的有機酸，主要存在于蔬果和谷物中，具有抗氧化，抗腫瘤，抗炎，殺菌，調(diào)節(jié)機體免疫力和保護心血管等生物功能[5,6]。陳萍紅[7]采用LC-Q-TOF-MS和LC-IT-MS檢測到肺寧顆粒中的87種成分里面有多種酚酸類成分，并對檢測出11種物質(zhì)具有抗炎活性，前期研究鑒定出返魂草提取物醇洗部分含有綠原酸等10種含量較高的酚酸，而目前，對返魂草中酚酸類物質(zhì)的抗氧化組分和活性還不明確。16HBE細胞系為永生的人支氣管上皮細胞，具有正常人呼吸道上皮細胞的功能，同時具有良好的遺傳穩(wěn)定性，被廣泛應用于急性肺損傷、肺部炎癥、氧化應激等方面的研究[8-9]。因此，本實驗采用16HBE細胞系來研究返魂草顆粒的抗氧化活性及作用機制。
本研究利用1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除實驗，確定返魂草抗氧化部位，并篩選出9種具有抗氧化活性的酚酸類物質(zhì)，在此基礎上更進一步研究返魂草的抗氧化活性，為返魂草顆粒在抗氧化和慢性支氣管炎、喘息性支氣管炎、急性呼吸道感染等抗炎方面的臨床應用提供理論依據(jù)。
1 儀器與材料
1.1 實驗儀器 BSA224S-CW型分析天平（德國賽多利斯股份有限公司），HH-2水浴鍋（江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所），UV-5100型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司），SW-CJ-2D雙人凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司），MCO-230AICUVL-PC型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本松下公司），iMark酶標儀（美國BIO-RAD），Ti-2型熒光倒置顯微鏡（日本尼康），普力菲爾分型超純水機（上海富詩特儀器設備有限公司）等。
1.2 材料與試劑
1.2.1 材料 返魂草顆粒，由吉林益民堂制藥有限公司提供（產(chǎn)地大興安嶺）。16HBE細胞系購自北納生物創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，資源編號BNCC338044。
1.2.2 試劑 D101大孔樹脂、DPPH、Vc、無水乙醇、甲醇、95%乙醇、二甲基亞砜（國藥集團化學試劑有限公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；3-（4，5-Dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide）（MTT）（美國Sigma公司）；ROS、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；金絲桃苷、綠原酸、異槲皮苷、紫云英苷、原兒茶酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、隱綠原酸、隱綠原酸標準品（中國食品藥品檢定研究院）。
2 實驗方法
2.1 返魂草提取物的分離 稱取5 g返魂草顆粒，加蒸餾水適量溶解，注入稀釋液至裝有大孔樹脂D101的柱子（2.5 cm×20 cm）中，用蒸餾水洗脫至溶液澄清，洗脫液濃縮，蒸干，得樣I（SCHE-I）。再用60%乙醇洗脫大孔樹脂柱，至溶液澄清，洗脫液濃縮，蒸干，得樣 II（SCHE-II）。
2.2 返魂草抗氧化部分的篩選 按照文獻[10]所述的方法，配制濃度為10～50 μg/mL的Vc溶液以及樣品溶液，以維生素C（Vc）為對照，分別考察SCHE-I、II清除DPPH自由基的能力。取各對照品溶液和樣品溶液2 mL與2 mL DPPH乙醇溶液混合搖勻，室溫下放置30 min后測517 nm處的吸光值，記為A1；取各對照液和樣品溶液2 mL與2 mL無水乙醇混合搖勻，室溫下放置30 min后測定吸光度值，記為A2；以2 mL無水乙醇加入2 mL水混合搖勻作為空白調(diào)零，2 mL無水乙醇加2 mL DPPH乙醇溶液混合搖勻測定吸光度值，記為A0。根據(jù)以下清除率公式計算清除率：清除率（%）= [1 -（A1-A2）/A0]×100%
以濃度（μg/mL）為橫坐標，清除率SA（%）為縱坐標作圖，計算IC50值。
2.3 SCHE-II中抗氧化組分的篩選 按2.2操作方法，配制濃度為20～100 μg/mL的Vc溶液以及樣品溶液。以Vc為對照液。測定和從SCHE-II中鑒別出含量較高的10種酚酸類物質(zhì)清除DPPH自由基的能力。
2.4 16HBE細胞氧化應激模型的建立與評價 按照文獻[11]所述方法，取處于對數(shù)生長期的細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板上，細胞密度為5～7×104個/mL，每孔100 μL。根據(jù)文獻[12]報道，高溫可以誘導細胞氧化應激和細胞凋亡，而48.3℃可以可以引起支氣管受損，將其分為空白組和高溫組（分別設50℃、54℃、58℃、62℃），每個溫度設6個復孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h。以細胞活力為指標通過MTT實驗考察高溫對16HBE的影響，并根據(jù)試劑盒說明書測定細胞上清液中SOD活力。
2.5 SCHE-II對高溫誘導的16HBE細胞活力的影響 按2.4操作方法，分為空白組、模型組和SCHEII低、中、高劑量組，采用54℃處理模型組和給藥組5 min后分別用37℃的完全培養(yǎng)基和含有SCHE-II濃度為0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、0.75 mg/mL和1 mg/mL的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h后測定細胞活力。
2.6 16HBE胞內(nèi)活性氧簇水平檢測 實驗分組與2.5分組方法相同，將細胞接種于12孔板中，細胞密度為5×104～7×104個/mL，每孔1000 μL，培養(yǎng)24 h后，根據(jù)試劑盒說明書配制濃度為10 μmoL的工作液，每孔加100 μL于37℃避光孵育15～30 min，結(jié)束培養(yǎng)后用PBS清洗細胞3次，并向板內(nèi)加入PBS溶液50 μL后于10×10倍鏡下觀察熒光強度并拍照。
2.7 樣本制備和抗氧化指標測定 收集細胞上清液于4℃高速3000 rpm離心10 min，取上清保存于- 20℃，待測。根據(jù)試劑盒說明書測定細胞上清液中T-AOC、GSH水平和抗氧化酶SOD、CAT活力。
2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用SPSS16.0處理數(shù)據(jù)，用均數(shù)±標準差（）表示結(jié)果。利用T-Test實驗檢驗顯著性，當P＜0.05時，數(shù)據(jù)有明顯差異；當P＜0.01時，數(shù)據(jù)有顯著性差異，當P＜0.001時，數(shù)據(jù)有極顯著性差異。
3 實驗結(jié)果
3.1 返魂草提取物對DPPH自由基清除率的檢測結(jié)果 返魂草顆粒中水溶性和醇溶性部分（SCHE-I和SCHE-II）對DPPH自由基清除效果見表1。
表1 SCHE對DPPH清除率的影響
結(jié)果如表1所示，返魂草顆粒中的水洗提取物SCHE-I在濃度10～50 μg/mL范圍內(nèi)無清除DPPH自由基的效果，而SCHE-II對DPPH的IC50為34.19%，其濃度為30 μg/mL時抗氧化能力與10 μg/mL的Vc相當。該結(jié)果說明，返魂草顆粒具有抗氧化功能，其中醇溶性部分為有效部位。
3.2 SCHE-II中10種組分單體對DPPH自由基清除率的檢測結(jié)果 為了進一步分析返魂草中的有效抗氧化組分，選取已經(jīng)被鑒定出的相對含量較高的10種酚酸類成分，以維生素C（Vc）為對照，分別考察其對DPPH自由基清除效果，實驗結(jié)果見表2。
實驗結(jié)果表明10種單體成分具有抗氧化作用，除紫云英苷單體其他9種單體化合物均具有較強的抗氧化能力，均與Vc的抗氧化能力相當。由此可見，SCHE-II表現(xiàn)出的抗氧化能力是多種組分協(xié)同作用的結(jié)果。
3.3 高溫誘導16HBE氧化應激模型的評價 根據(jù)MTT實驗和細胞上清液中SOD活力篩選建立16HBE細胞氧化損傷模型的溫度，實驗結(jié)果見表3。
由表3可知，高溫建模溫度在50～62℃范圍內(nèi)對細胞活力和SOD活力呈溫度依賴性下降趨勢。其中，50℃處理細胞后，16HBE細胞活力在48 h恢復到與37℃相當，而54℃、58℃和62℃均可以引起16HBE在48 h內(nèi)細胞活力顯著下降，為了避免過高溫度引起細胞凋亡，采用54℃為建模溫度。
表2 SCHE-II中各單體成分對DPPH清除率的影響
表3 高溫對16HBE細胞活力及SOD活力的影響（ ，n = 6）
表3 高溫對16HBE細胞活力及SOD活力的影響（ ，n = 6）
注：與空白對照組（37℃）比較，# P＜0.05；## P＜0.01；### P＜0.001
組 別 24 h 48 h OD490 SOD/（U/mL） OD490 SOD/（U/mL）37℃組 0.649±0.041 172.4±10.8 0.681±0.066 160.8±5.1 50℃組 0.560±0.066# 165.8±12.1 0.646±0.080 154.6±4.9 54℃組 0.535±0.085## 132.0±7.4## 0.557±0.052### 120.8±8.4###58℃組 0.467±0.069### 128.1±14.6### 0.397±0.037### 97.4±10.5###62℃組 0.420±0.048### 110.8±8.3### 0.271±0.058### 102.9±2.4###
3.4 SCHE-II對高溫誘導的16HBE細胞活力的影響 采用MTT實驗測定SCHE-II對高溫損傷后的16HBE細胞活力的影響。根據(jù)圖1可知，經(jīng)過高溫處理后，模型組細胞活力較空白組顯著下降（P＜0.01），經(jīng)過SCHE-II治療后，細胞活力較模型組發(fā)生顯著提升：其中，提取物濃度為1 mg/mL和0.1 mg/mL時細胞活力較模型組沒有顯著變化；提取物濃度在0.75～0.25 mg/mL范圍內(nèi)可以有效恢復由高溫誘導的16HBE細胞活力下降的問題。根據(jù)細胞活力測定結(jié)果，確定SCHE-II作用濃度為0.25 mg/mL，0.5 mg/mL和0.75 mg/mL。
3.5 SCHE-II對16HBE胞內(nèi)氧化應激水平的影響 為了考察返魂草提取物對16HBE胞內(nèi)的氧化應激水平的影響，進行DCFH-DA染色實驗?；钚匝醴肿樱╮eactive oxygen species, ROS）是氧代謝過程的副產(chǎn)品，在氧化應激階段，ROS水平顯著增加，進而導致細胞結(jié)構(gòu)的重大破壞[13]。ROS測定結(jié)果見圖2，綠色熒光強度代表ROS水平，模型組細胞數(shù)量較其他組有明顯減少現(xiàn)象，并且在ROS水平較空白組顯著增加；而SCHE-II劑量依賴性降低16HBE細胞內(nèi)由高溫引起的氧化應激狀態(tài)。3.6 SCHE-II對16HBE中抗氧化活性物質(zhì)的影響 根據(jù)表3可知，16HBE經(jīng)過54℃高溫培養(yǎng)基孵育5 min后，細胞的總抗氧化能力（T-AOC）、抗氧化酶SOD和CAT以及抗氧化物還原型谷胱甘肽（GSH）較空白組均有明顯下降（P＜0.05），說明高溫可以誘導16HBE細胞氧化水平增加。與模型組相比，16HBE細胞經(jīng)過SCHE-II孵育24 h后，各項抗氧化指標均以劑量依賴性方式顯著提升，其中SCHE-II對SOD活力作用最顯著，可以將SOD活力提升至空白組的5倍以上。
圖1 SCHE-II對高溫誘導的16HBE細胞活力的影響
圖2 SCHE-II對16HBE胞內(nèi)ROS水平的影響（100×，比例尺100 μm）
表3 SCHE-II對16HBE中抗氧化酶和GSH的影響（ ，n = 3）
表3 SCHE-II對16HBE中抗氧化酶和GSH的影響（ ，n = 3）
注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01， ### P＜0.001；與模型組比較，△△ P＜0.01，△△△P＜0.001
組 別 T-AOC/mM SOD/（U/mL） CAT/（U/mL） GSH/（μmol/L）空白組 0.118±0.087 159.6±17.9 116.1±10.3 68.4±13.2模型組 0.077±0.121### 123.8±12.5# 88.5±15.0## 58.2±4.20#SCHE-110.25 mg/mL 0.090±0.088△△ 839.3±84.5###△△△ 104.9±16.2△△ 60.6±3.31 SCHE-110.50 mg/mL 0.116±0.113△△△ 984.3±47.7###△△△ 120.1±8.9△△△ 80.7±6.34△△SCHE-110.75 mg/mL 0.125±0.206△△△ 1292.1±21.6###△△△ 132.6±12.8#△△△ 93.5±8.54##△△△
4 討論
本研究通過DPPH自由基清除實驗篩選出返魂草顆粒有效的抗氧化部位為60%乙醇洗脫D101大孔樹脂得到的提取物（SCHE-II），其對DPPH自由基清除作用的半數(shù)抑制濃度（IC50）為34.19 μg/mL。經(jīng)前期實驗鑒定，SCHE-II中金絲桃苷、綠原酸、異槲皮苷、原兒茶酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、隱綠原酸、新綠原酸等9種含量較高的酚酸組分對DPPH的IC50均在10～15 μg/mL之間，具有與Vc相當?shù)目寡趸钚浴?/p>
SCHE-II在16HBE氧化損傷模型中發(fā)揮較強的抗氧化作用。通過54℃高溫孵育5 min可以使16HBE細胞活力和SOD活力下降至80%左右，造成細胞的氧化損傷。SCHE-II以劑量依賴性降低高溫誘導的16HBE胞內(nèi)氧化應激水平，顯著增加細胞的總抗氧化能力，并提升細胞GSH水平和SOD及CAT活力。GSH是機體內(nèi)含量最高的非酶性抗氧化物，能夠防止活性氧對細胞的損傷[14,15]，而SOD和CAT作為抗氧化酶在機體內(nèi)可以通過氧化還原反應抑制自由基氧化損傷，達到預防氧化應激所造成的各種老化性疾病[16]。另外，氧化應激還參與細胞及機體的炎癥、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等生理活動，特別是免疫系統(tǒng)細胞更易因氧化應激遭受損傷,導致機體穩(wěn)態(tài)平衡的破壞[17,18]，此外，氧化應激反應是炎癥反應的一部分，其會導致中性粒細胞炎性浸潤，進而誘導局部炎癥[19,20]。
由此提示，返魂草提取物可有效改善支氣管上皮細胞的氧化應激狀態(tài)，提升抗氧化酶活力和機體的自由基清除能力，為明確返魂草抗氧化的功效物質(zhì)基礎以及在抗氧化和抗炎方面的開發(fā)應用提供了理論基礎。
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返魂草（senecionis cannabifolii herba, SCH）又名青菀、紫倩等，為菊科千里光屬多年生草本植物，主要分布在我國東北、西北和華北地區(qū)，具有抗病毒、抗菌、抗急性肺損傷、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、解熱抗胃潰瘍等活性，因此被廣泛應用于止咳平喘、肺部急性炎癥、慢性炎癥的治療，返魂草顆粒是由返魂草為原料經(jīng)水提得到的的單方制劑[1-3]；此外，祁海燕等[4]證明了以返魂草提取物為主要成分的返魂草顆粒（肺寧顆粒）可以上調(diào)AECOPD大鼠模型中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）水平，提示返魂草在抗氧化方面具有一定潛力，但目前對返魂草提取物中的抗氧化成分及其作用機制的研究還不深入。
酚酸（phenolic acids）是一類含有酚環(huán)的有機酸，主要存在于蔬果和谷物中，具有抗氧化，抗腫瘤，抗炎，殺菌，調(diào)節(jié)機體免疫力和保護心血管等生物功能[5,6]。陳萍紅[7]采用LC-Q-TOF-MS和LC-IT-MS檢測到肺寧顆粒中的87種成分里面有多種酚酸類成分，并對檢測出11種物質(zhì)具有抗炎活性，前期研究鑒定出返魂草提取物醇洗部分含有綠原酸等10種含量較高的酚酸，而目前，對返魂草中酚酸類物質(zhì)的抗氧化組分和活性還不明確。16HBE細胞系為永生的人支氣管上皮細胞，具有正常人呼吸道上皮細胞的功能，同時具有良好的遺傳穩(wěn)定性，被廣泛應用于急性肺損傷、肺部炎癥、氧化應激等方面的研究[8-9]。因此，本實驗采用16HBE細胞系來研究返魂草顆粒的抗氧化活性及作用機制。
本研究利用1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除實驗，確定返魂草抗氧化部位，并篩選出9種具有抗氧化活性的酚酸類物質(zhì)，在此基礎上更進一步研究返魂草的抗氧化活性，為返魂草顆粒在抗氧化和慢性支氣管炎、喘息性支氣管炎、急性呼吸道感染等抗炎方面的臨床應用提供理論依據(jù)。
1 儀器與材料
1.1 實驗儀器 BSA224S-CW型分析天平（德國賽多利斯股份有限公司），HH-2水浴鍋（江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所），UV-5100型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司），SW-CJ-2D雙人凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司），MCO-230AICUVL-PC型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本松下公司），iMark酶標儀（美國BIO-RAD），Ti-2型熒光倒置顯微鏡（日本尼康），普力菲爾分型超純水機（上海富詩特儀器設備有限公司）等。
1.2 材料與試劑
1.2.1 材料 返魂草顆粒，由吉林益民堂制藥有限公司提供（產(chǎn)地大興安嶺）。16HBE細胞系購自北納生物創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，資源編號BNCC338044。
1.2.2 試劑 D101大孔樹脂、DPPH、Vc、無水乙醇、甲醇、95%乙醇、二甲基亞砜（國藥集團化學試劑有限公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；3-（4，5-Dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide）（MTT）（美國Sigma公司）；ROS、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；金絲桃苷、綠原酸、異槲皮苷、紫云英苷、原兒茶酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、隱綠原酸、隱綠原酸標準品（中國食品藥品檢定研究院）。
2 實驗方法
2.1 返魂草提取物的分離 稱取5 g返魂草顆粒，加蒸餾水適量溶解，注入稀釋液至裝有大孔樹脂D101的柱子（2.5 cm×20 cm）中，用蒸餾水洗脫至溶液澄清，洗脫液濃縮，蒸干，得樣I（SCHE-I）。再用60%乙醇洗脫大孔樹脂柱，至溶液澄清，洗脫液濃縮，蒸干，得樣 II（SCHE-II）。
2.2 返魂草抗氧化部分的篩選 按照文獻[10]所述的方法，配制濃度為10～50 μg/mL的Vc溶液以及樣品溶液，以維生素C（Vc）為對照，分別考察SCHE-I、II清除DPPH自由基的能力。取各對照品溶液和樣品溶液2 mL與2 mL DPPH乙醇溶液混合搖勻，室溫下放置30 min后測517 nm處的吸光值，記為A1；取各對照液和樣品溶液2 mL與2 mL無水乙醇混合搖勻，室溫下放置30 min后測定吸光度值，記為A2；以2 mL無水乙醇加入2 mL水混合搖勻作為空白調(diào)零，2 mL無水乙醇加2 mL DPPH乙醇溶液混合搖勻測定吸光度值，記為A0。根據(jù)以下清除率公式計算清除率：清除率（%）= [1 -（A1-A2）/A0]×100%
以濃度（μg/mL）為橫坐標，清除率SA（%）為縱坐標作圖，計算IC50值。
2.3 SCHE-II中抗氧化組分的篩選 按2.2操作方法，配制濃度為20～100 μg/mL的Vc溶液以及樣品溶液。以Vc為對照液。測定和從SCHE-II中鑒別出含量較高的10種酚酸類物質(zhì)清除DPPH自由基的能力。
2.4 16HBE細胞氧化應激模型的建立與評價 按照文獻[11]所述方法，取處于對數(shù)生長期的細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板上，細胞密度為5～7×104個/mL，每孔100 μL。根據(jù)文獻[12]報道，高溫可以誘導細胞氧化應激和細胞凋亡，而48.3℃可以可以引起支氣管受損，將其分為空白組和高溫組（分別設50℃、54℃、58℃、62℃），每個溫度設6個復孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h。以細胞活力為指標通過MTT實驗考察高溫對16HBE的影響，并根據(jù)試劑盒說明書測定細胞上清液中SOD活力。
2.5 SCHE-II對高溫誘導的16HBE細胞活力的影響 按2.4操作方法，分為空白組、模型組和SCHEII低、中、高劑量組，采用54℃處理模型組和給藥組5 min后分別用37℃的完全培養(yǎng)基和含有SCHE-II濃度為0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、0.75 mg/mL和1 mg/mL的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h后測定細胞活力。
2.6 16HBE胞內(nèi)活性氧簇水平檢測 實驗分組與2.5分組方法相同，將細胞接種于12孔板中，細胞密度為5×104～7×104個/mL，每孔1000 μL，培養(yǎng)24 h后，根據(jù)試劑盒說明書配制濃度為10 μmoL的工作液，每孔加100 μL于37℃避光孵育15～30 min，結(jié)束培養(yǎng)后用PBS清洗細胞3次，并向板內(nèi)加入PBS溶液50 μL后于10×10倍鏡下觀察熒光強度并拍照。
2.7 樣本制備和抗氧化指標測定 收集細胞上清液于4℃高速3000 rpm離心10 min，取上清保存于- 20℃，待測。根據(jù)試劑盒說明書測定細胞上清液中T-AOC、GSH水平和抗氧化酶SOD、CAT活力。
2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用SPSS16.0處理數(shù)據(jù)，用均數(shù)±標準差（）表示結(jié)果。利用T-Test實驗檢驗顯著性，當P＜0.05時，數(shù)據(jù)有明顯差異；當P＜0.01時，數(shù)據(jù)有顯著性差異，當P＜0.001時，數(shù)據(jù)有極顯著性差異。
3 實驗結(jié)果
3.1 返魂草提取物對DPPH自由基清除率的檢測結(jié)果 返魂草顆粒中水溶性和醇溶性部分（SCHE-I和SCHE-II）對DPPH自由基清除效果見表1。
表1 SCHE對DPPH清除率的影響
結(jié)果如表1所示，返魂草顆粒中的水洗提取物SCHE-I在濃度10～50 μg/mL范圍內(nèi)無清除DPPH自由基的效果，而SCHE-II對DPPH的IC50為34.19%，其濃度為30 μg/mL時抗氧化能力與10 μg/mL的Vc相當。該結(jié)果說明，返魂草顆粒具有抗氧化功能，其中醇溶性部分為有效部位。
3.2 SCHE-II中10種組分單體對DPPH自由基清除率的檢測結(jié)果 為了進一步分析返魂草中的有效抗氧化組分，選取已經(jīng)被鑒定出的相對含量較高的10種酚酸類成分，以維生素C（Vc）為對照，分別考察其對DPPH自由基清除效果，實驗結(jié)果見表2。
實驗結(jié)果表明10種單體成分具有抗氧化作用，除紫云英苷單體其他9種單體化合物均具有較強的抗氧化能力，均與Vc的抗氧化能力相當。由此可見，SCHE-II表現(xiàn)出的抗氧化能力是多種組分協(xié)同作用的結(jié)果。
3.3 高溫誘導16HBE氧化應激模型的評價 根據(jù)MTT實驗和細胞上清液中SOD活力篩選建立16HBE細胞氧化損傷模型的溫度，實驗結(jié)果見表3。
由表3可知，高溫建模溫度在50～62℃范圍內(nèi)對細胞活力和SOD活力呈溫度依賴性下降趨勢。其中，50℃處理細胞后，16HBE細胞活力在48 h恢復到與37℃相當，而54℃、58℃和62℃均可以引起16HBE在48 h內(nèi)細胞活力顯著下降，為了避免過高溫度引起細胞凋亡，采用54℃為建模溫度。
表2 SCHE-II中各單體成分對DPPH清除率的影響
表3 高溫對16HBE細胞活力及SOD活力的影響（ ，n = 6）
表3 高溫對16HBE細胞活力及SOD活力的影響（ ，n = 6）
注：與空白對照組（37℃）比較，# P＜0.05；## P＜0.01；### P＜0.001
組 別 24 h 48 h OD490 SOD/（U/mL） OD490 SOD/（U/mL）37℃組 0.649±0.041 172.4±10.8 0.681±0.066 160.8±5.1 50℃組 0.560±0.066# 165.8±12.1 0.646±0.080 154.6±4.9 54℃組 0.535±0.085## 132.0±7.4## 0.557±0.052### 120.8±8.4###58℃組 0.467±0.069### 128.1±14.6### 0.397±0.037### 97.4±10.5###62℃組 0.420±0.048### 110.8±8.3### 0.271±0.058### 102.9±2.4###
3.4 SCHE-II對高溫誘導的16HBE細胞活力的影響 采用MTT實驗測定SCHE-II對高溫損傷后的16HBE細胞活力的影響。根據(jù)圖1可知，經(jīng)過高溫處理后，模型組細胞活力較空白組顯著下降（P＜0.01），經(jīng)過SCHE-II治療后，細胞活力較模型組發(fā)生顯著提升：其中，提取物濃度為1 mg/mL和0.1 mg/mL時細胞活力較模型組沒有顯著變化；提取物濃度在0.75～0.25 mg/mL范圍內(nèi)可以有效恢復由高溫誘導的16HBE細胞活力下降的問題。根據(jù)細胞活力測定結(jié)果，確定SCHE-II作用濃度為0.25 mg/mL，0.5 mg/mL和0.75 mg/mL。
3.5 SCHE-II對16HBE胞內(nèi)氧化應激水平的影響 為了考察返魂草提取物對16HBE胞內(nèi)的氧化應激水平的影響，進行DCFH-DA染色實驗?；钚匝醴肿樱╮eactive oxygen species, ROS）是氧代謝過程的副產(chǎn)品，在氧化應激階段，ROS水平顯著增加，進而導致細胞結(jié)構(gòu)的重大破壞[13]。ROS測定結(jié)果見圖2，綠色熒光強度代表ROS水平，模型組細胞數(shù)量較其他組有明顯減少現(xiàn)象，并且在ROS水平較空白組顯著增加；而SCHE-II劑量依賴性降低16HBE細胞內(nèi)由高溫引起的氧化應激狀態(tài)。3.6 SCHE-II對16HBE中抗氧化活性物質(zhì)的影響 根據(jù)表3可知，16HBE經(jīng)過54℃高溫培養(yǎng)基孵育5 min后，細胞的總抗氧化能力（T-AOC）、抗氧化酶SOD和CAT以及抗氧化物還原型谷胱甘肽（GSH）較空白組均有明顯下降（P＜0.05），說明高溫可以誘導16HBE細胞氧化水平增加。與模型組相比，16HBE細胞經(jīng)過SCHE-II孵育24 h后，各項抗氧化指標均以劑量依賴性方式顯著提升，其中SCHE-II對SOD活力作用最顯著，可以將SOD活力提升至空白組的5倍以上。
圖1 SCHE-II對高溫誘導的16HBE細胞活力的影響
圖2 SCHE-II對16HBE胞內(nèi)ROS水平的影響（100×，比例尺100 μm）
表3 SCHE-II對16HBE中抗氧化酶和GSH的影響（ ，n = 3）
表3 SCHE-II對16HBE中抗氧化酶和GSH的影響（ ，n = 3）
注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01， ### P＜0.001；與模型組比較，△△ P＜0.01，△△△P＜0.001
組 別 T-AOC/mM SOD/（U/mL） CAT/（U/mL） GSH/（μmol/L）空白組 0.118±0.087 159.6±17.9 116.1±10.3 68.4±13.2模型組 0.077±0.121### 123.8±12.5# 88.5±15.0## 58.2±4.20#SCHE-110.25 mg/mL 0.090±0.088△△ 839.3±84.5###△△△ 104.9±16.2△△ 60.6±3.31 SCHE-110.50 mg/mL 0.116±0.113△△△ 984.3±47.7###△△△ 120.1±8.9△△△ 80.7±6.34△△SCHE-110.75 mg/mL 0.125±0.206△△△ 1292.1±21.6###△△△ 132.6±12.8#△△△ 93.5±8.54##△△△
4 討論
本研究通過DPPH自由基清除實驗篩選出返魂草顆粒有效的抗氧化部位為60%乙醇洗脫D101大孔樹脂得到的提取物（SCHE-II），其對DPPH自由基清除作用的半數(shù)抑制濃度（IC50）為34.19 μg/mL。經(jīng)前期實驗鑒定，SCHE-II中金絲桃苷、綠原酸、異槲皮苷、原兒茶酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、隱綠原酸、新綠原酸等9種含量較高的酚酸組分對DPPH的IC50均在10～15 μg/mL之間，具有與Vc相當?shù)目寡趸钚浴?/p>
SCHE-II在16HBE氧化損傷模型中發(fā)揮較強的抗氧化作用。通過54℃高溫孵育5 min可以使16HBE細胞活力和SOD活力下降至80%左右，造成細胞的氧化損傷。SCHE-II以劑量依賴性降低高溫誘導的16HBE胞內(nèi)氧化應激水平，顯著增加細胞的總抗氧化能力，并提升細胞GSH水平和SOD及CAT活力。GSH是機體內(nèi)含量最高的非酶性抗氧化物，能夠防止活性氧對細胞的損傷[14,15]，而SOD和CAT作為抗氧化酶在機體內(nèi)可以通過氧化還原反應抑制自由基氧化損傷，達到預防氧化應激所造成的各種老化性疾病[16]。另外，氧化應激還參與細胞及機體的炎癥、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等生理活動，特別是免疫系統(tǒng)細胞更易因氧化應激遭受損傷,導致機體穩(wěn)態(tài)平衡的破壞[17,18]，此外，氧化應激反應是炎癥反應的一部分，其會導致中性粒細胞炎性浸潤，進而誘導局部炎癥[19,20]。
由此提示，返魂草提取物可有效改善支氣管上皮細胞的氧化應激狀態(tài)，提升抗氧化酶活力和機體的自由基清除能力，為明確返魂草抗氧化的功效物質(zhì)基礎以及在抗氧化和抗炎方面的開發(fā)應用提供了理論基礎。
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