3 種不同品種沙棘葉中沒(méi)食子酸含量的測(cè)定

張 欣，張雪娟，王小莉，郭海利，姚 瑩，張小民

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西金科海生物科技有限公司，山西太原030006）

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）又名黑刺、醋柳、酸刺等，屬于薔薇目胡頹子科沙棘屬，落葉灌喬木。在我國(guó)，沙棘主要分布于山西、陜西、甘肅、青海、內(nèi)蒙古、河北等地[1]。據(jù)報(bào)道[2]，沙棘屬植物有7 個(gè)種11 個(gè)亞種，而我國(guó)含有7 個(gè)種（柳葉沙棘、沙棘、肋果沙棘、棱果沙棘、西藏沙棘、理塘沙棘、江孜沙棘）和7 個(gè)亞種（云南沙棘亞種、臥龍沙棘亞種、蒙古沙棘亞種、中亞沙棘亞種、中國(guó)沙棘亞種、江孜沙棘亞種、密毛肋果沙棘亞種）。山西省分布的野生沙棘全部為中國(guó)沙棘[3]，2011 年水利部在太谷縣設(shè)立了沙棘新品種試驗(yàn)基地種植沙棘新品種，阜雜1 號(hào)和雜優(yōu)54 號(hào)于2012 年引自水利部鄂爾多斯沙棘種植基地。近年來(lái)，對(duì)沙棘的研究主要集中在沙棘結(jié)構(gòu)[4-5]和沙棘果油籽油的開(kāi)發(fā)[6-7]，對(duì)沙棘葉的研究較少，沙棘中多酚類(lèi)化合物主要以沒(méi)食子酸為母核[8]。沒(méi)食子酸又稱(chēng)五倍子酸，其化學(xué)名稱(chēng)為3，4，5- 三羥基苯甲酸，廣泛存在于各種植物中，是化學(xué)結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的天然多酚類(lèi)化合物[9]。沒(méi)食子酸具有保護(hù)心血管的作用，如抗高血壓、抗心肌梗死、抗血管鈣化；還具有保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗糖尿病和抗肝纖維化作用[9]。此外，沒(méi)食子酸還對(duì)腫瘤細(xì)胞（如胰腺癌、肺癌、前列腺癌、皮膚癌、白血病、胃癌等）有殺傷作用[10-14]。因此，對(duì)沒(méi)食子酸的研究具有廣闊的應(yīng)用前景。

沙棘多酚的測(cè)定方法多采用比色法，其準(zhǔn)確度較低，且少有人測(cè)定沒(méi)食子酸的含量。

本研究采用高效液相色譜法，測(cè)定比較了山西中國(guó)沙棘以及水利部推廣的新品種沙棘阜雜1 號(hào)和雜優(yōu)54 號(hào)的沒(méi)食子酸含量，旨在為沙棘葉的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試沙棘品種為中國(guó)沙棘、阜雜1 號(hào)和雜優(yōu)54 號(hào)，其中，中國(guó)沙棘為山西省野生品種；阜雜1號(hào)和雜優(yōu)54 號(hào)種植于山西省太谷縣任村鄉(xiāng)郝村水利部沙棘新品種試驗(yàn)基地。

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑

島津高效液相色譜儀（LC-2030C3D）；昆山超聲波清洗機(jī)（KQ-500DE）；超純水機(jī)（密理博SimplicityUV）；電子分析天平（梅特勒XSE205DU）。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品采自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)（CAS149-91-7）；水為超純水（超純水機(jī)制備）；甲醇為高效液相色譜級(jí)；其他試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱為AmethystC18-11（4.6mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇∶0.1%磷酸（15∶85）；柱溫為30 ℃；流速為1.00 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為273 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.2 溶液配制

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品10 mg，置于10 mL 容量瓶中，加入甲醇，溶解稀釋至刻度后搖勻，作為對(duì)照品溶液，溶液濃度為1.125 g/L，備用。

1.3.2.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取沙棘葉粉末1 g，置于50 mL 容量瓶中，加50 mL 甲醇溶解，超聲提取1 h（功率500 W，頻率40 kHz），待溶液冷卻至室溫后，甲醇補(bǔ)足減失的量，搖勻；用0.22 μm的有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，取濾液，即為供試樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸對(duì)照品的HPLC 分析

在1.3.1 色譜條件下測(cè)得沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖如圖1 所示，沒(méi)食子酸出峰時(shí)間為6.290min。

2.2 線(xiàn)性關(guān)系的考察

精密吸取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液5，10，15，20，30，40，60 μg/mL，在1.3.1 色譜條件下，注入高效液相色譜儀中，測(cè)定其峰值。以沒(méi)食子酸的進(jìn)樣量（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，得到回歸線(xiàn)方程y＝41 165.3x-123 188（n＝7，R2＝0.998 1），結(jié)果如圖2 所示，表明對(duì)照品沒(méi)食子酸進(jìn)樣量為5～60 μg/mL 時(shí)，與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn)

在1.3.1 色譜條件下，取30 μg/mL 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5 次，結(jié)果測(cè)得沒(méi)食子酸峰面積的RSD 為1.02%（n＝5），說(shuō)明該儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在1.3.1 色譜條件下，于0，2，4，8，12 h 測(cè)得沒(méi)食子酸峰面積RSD 值為1.11%（n＝5），說(shuō)明在12 h內(nèi)沒(méi)食子酸穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

在1.3.1 色譜條件下，取6 份中國(guó)沙棘葉供試品，分別進(jìn)樣，測(cè)得沒(méi)食子酸峰面積RSD 值為1.28%（n＝6），說(shuō)明該方法重現(xiàn)性良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的供試品5 份，每份約0.5 g，置于50 mL 容量瓶中，再分別精密加入0.5 mL 質(zhì)量濃度為1.125 g/L 的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.3.2.2方法制備5 份供試品溶液，在1.3.1 色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得結(jié)果如表1 所示，結(jié)果顯示，回收率平均為97.42%，RSD 值為0.42%。說(shuō)明該試驗(yàn)沒(méi)食子酸的加標(biāo)回收率符合要求。

表1 沙棘葉沒(méi)食子酸回收率測(cè)定結(jié)果

2.7 樣品含量測(cè)定

按照1.3.2.2 方法制得供試品，在1.3.1 色譜條件下測(cè)定不同品種沙棘葉中沒(méi)食子酸的含量，由表2 可知，沙棘葉中沒(méi)食子酸的含量由大到小依次為中國(guó)沙棘＞雜優(yōu)54 號(hào)＞阜雜1 號(hào)。

表2 不同品種沙棘葉中沒(méi)食子酸含量測(cè)定 mg/g

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)利用高效液相色譜儀測(cè)定不同品種的沙棘葉中沒(méi)食子酸的含量。取沙棘葉粉末，用甲醇在超聲波輔助下提取1 h，再經(jīng)0.22 μm 的有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾后，利用高效液相色譜法測(cè)定不同品種的沙棘葉中沒(méi)食子酸的含量。結(jié)果表明，沒(méi)食子酸的進(jìn)樣量為5～60 μg/mL 時(shí)與峰面積呈良好線(xiàn)性關(guān)系，且中國(guó)沙棘葉中的沒(méi)食子酸含量最多，雜優(yōu)54 號(hào)次之，阜雜1 號(hào)沒(méi)食子酸含量最少。阜雜1 號(hào)和雜優(yōu)54 號(hào)沙棘早熟，果大且多，色澤鮮艷，口感較好；中國(guó)沙棘雖然晚熟果的口感酸澀，但其葉的營(yíng)養(yǎng)成分含量?jī)?yōu)于阜雜1 號(hào)和雜優(yōu)54 號(hào)，二者在利用價(jià)值上各有利弊。牟丹等[15]采用比色法，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得青海地區(qū)沙棘葉中總多酚的含量為（15.34±1.88）mg/L，與本試驗(yàn)結(jié)果存在差異，可能是由于提取條件不同。敬思群[16]以沒(méi)食子酸為標(biāo)品，采取分光光度法測(cè)得沙棘葉中多酚提取液的吸光度為7.385 mg/g，所測(cè)含量比本試驗(yàn)結(jié)果高，可能是由于測(cè)定方法不同。

山西省的野生沙棘面積居于我國(guó)首位[17]，其資源豐富，開(kāi)發(fā)利用前景廣闊，目前我國(guó)對(duì)沙棘的開(kāi)發(fā)利用主要為沙棘果和沙棘葉，其中，沙棘果的開(kāi)發(fā)主要包括沙棘籽油、沙棘果油、沙棘汁等，沙棘葉的開(kāi)發(fā)主要為沙棘茶[18]。根據(jù)前人的研究結(jié)果，沙棘葉中除了沒(méi)食子酸外還含有大量蘆丁以及科羅索酸[19-20]，且沒(méi)食子酸對(duì)多種癌細(xì)胞都有抑制作用。周菲菲等[21]研究結(jié)果表明，增強(qiáng)Caspase-3 表達(dá)誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞凋亡；羅強(qiáng)等[22]研究結(jié)果表明，沒(méi)食子酸通過(guò)上調(diào)p53 基因表達(dá)、下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)，誘導(dǎo)Hela 細(xì)胞凋亡；王瑩等[10]研究認(rèn)為，沒(méi)食子酸可能通過(guò)線(xiàn)粒體信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)人胰腺癌MIA Paca-2 細(xì)胞凋亡；ISHIHARA 等[23]研究表明，沒(méi)食子酸對(duì)人白血病細(xì)胞（HK-63）活性具有一定的抑制作用；沒(méi)食子酸還被證實(shí)能降低人肺腺癌細(xì)胞（PC-14）和人胃腺癌細(xì)胞（MKN45）等人類(lèi)癌細(xì)胞系的存活率[24]。沙棘葉中含有大量的沒(méi)食子酸，表明其具有抗癌作用。沙棘在抗癌藥的開(kāi)發(fā)方面具有廣闊前景。