參菖益智膠囊的質(zhì)量研究

張德珂，李 季，李 ，曲遠均

（山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014）

老年癡呆一種起病隱匿的進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以記憶力下降、認知功能障礙、意識障礙、生活自理能力及社會活動能力下降甚至喪失為特征[1]。中醫(yī)學認為本虛表實是老年癡呆病的重要發(fā)病機制之一，其次是痰瘀痹阻、腎精虧虛及心腎不交，治療以滋補、交通心腎、疏肝解郁為大法[2]，治療時大多采用補虛、清熱、安神、活血化瘀、平肝息風、化痰止咳平喘之藥[3]。用于治療老年癡呆的中藥材大多具有活血化瘀，補虛，清熱等功效[4]。另外灸法[5]，食物療法[6]等非藥物的中醫(yī)治療手段也經(jīng)常被應用。

參菖益智膠囊以開竅寧神、益智健腦為治則，由人參與石菖蒲兩味中藥組成；人參主補益，石菖蒲主開竅，二者相輔相成，臨床療效確切。未制定任何質(zhì)量控制方法，為了保證藥物質(zhì)量和療效，對復方中有效成分進行鑒別和含量測定。目前常用于中藥及其制劑控制的方法包括薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法和色譜質(zhì)譜聯(lián)用等[7]。本文對制劑中人參和石菖蒲進行TLC鑒別，對人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量進行HPLC測定，作為參菖益智膠囊質(zhì)量控制的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Aglient 1260型高效液相色譜儀；AV412電子天平；CP2250型分析天平；SHB-Ⅲ真空泵；LC-600B型數(shù)控超聲波清洗機；XMTD-4000型電熱恒溫水浴鍋。

1.2 材料與試藥

人參皂苷Rg1對照品（含量91.7 %，批號：110703-201530），人參皂苷Re對照品（含量100 %，批號：110754-200421），人參皂苷Rb1對照品（含量100 %，批號：110704-200420），均購于中國食品藥品檢定研究院；參菖益智膠囊樣品（自制，批號20171010，20171020，20171030）和陰性對照。甲醇，乙腈，磷酸為色譜純，95 %乙醇為分析純；水是娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司），其余試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 人參的TLC鑒別

取本品內(nèi)容物顆粒約5 g，加二氯甲烷40 ml，加熱回流1 h，棄去二氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，加水飽和的正丁醇30 ml，超聲處理30 min，吸取上清加3倍量的氨試液，搖勻，放置分層，取上層液蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。取人參皂苷Rg1對照品，人參皂苷Re對照品及人參皂苷Rb1對照品，加甲醇制成每1 ml各約含2 mg混合溶液，作為混合對照品溶液。另取人參皂苷Rg1對照品，人參皂苷Re對照品及人參皂苷Rb1對照品，分別加甲醇制成每1 ml約含2 mg對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗，吸取上述5種溶液各5 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15:40:22:10）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，見圖1。

結(jié)果為在與混合對照品和對照品色譜相應位置上，供試品顯相同顏色的斑點，且自制不含人參的陰性樣品無干擾。

2.2 石菖蒲的TLC鑒別

取本品顆粒約5 g，加石油醚（60～90 ℃）20 ml，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加石油醚（60～90 ℃）1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取石菖蒲對照藥材0.2 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗，吸取上述兩種溶液各5 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（4:1）為展開劑，展開，取出，晾干，放置約1 h，置紫外光燈（365 nm）下檢視，見圖2。

結(jié)果為在與對照藥材色譜相應的位置上，供試品顯相同顏色的熒光斑點，且自制不含石菖蒲的陰性樣品無干擾。

圖1 處方中人參的TLC鑒別

圖2 處方中石菖蒲的TLC鑒別

3 含量測定[8-11]

3.1 色譜條件

Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈（A）-0.1 %磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫0～35 min：19 %A（81 %B）；35～55 min：19 % A→29 % A（81 % B→71 % B）；55～70 min：29 % A（71 % B）；70～100 min：29 % A→40 %A（71 % B→60 % B）；流速為1.3 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：203 nm；進樣量：10 μl。

3.2 溶液配制

對照品溶液：分別取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml各約含200 μg的溶液，即得。

供試品溶液：取本品顆粒5 g，精密稱定，置索氏提取器中，加二氯甲烷加熱回流3 h，棄去二氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，移入250 ml圓底燒瓶，精密加入蒸餾水100 ml，回流加熱1 h，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液25 ml，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照溶液：按處方比例，不加人參藥材，制得缺人參的模擬制劑，按上述方法制備。

3.3 系統(tǒng)適應性試驗

精密量取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照液各10 μl，注入高效液相色譜儀，見圖3。結(jié)果供試樣品在混合對照品色譜峰相應的位置有相應色譜峰出現(xiàn)，陰性樣品無干擾。

圖3 參菖益智膠囊高效液相色譜圖

3.4 線性試驗

精密吸取混合對照品溶液2，4，6，8，10，12 μl注入高效液相色譜儀中進行分析，記錄峰面積。以峰面積Y對進樣量X（μg）進行線性回歸，見表1，結(jié)果表明各成分在考察濃度范圍內(nèi)線性良好。

表1 人參皂苷Rg1、Re、Rb1的回歸方程、線性范圍

3.5 精密度試驗

儀器精密度實驗：精密吸取混合對照品溶液，按重復進樣6次，分別測定人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的峰面積。結(jié)果：人參皂苷Rg1的平均峰面積為623.30，RSD=0.11 %；人參皂苷Re的平均峰面積為545.48，RSD=0.16 %；人參皂苷Rb1的平均峰面積為508.32；RSD=0.12 %；表明儀器的精密度良好。

重復性試驗：取同一批次樣品（批號：20171010）適量，按3.2項下供試品溶液制備方法，平行制備6份供試品溶液進行測定，采用外標法以峰面積計算含量。結(jié)果：人參皂苷Rg1的含量平均值為0.16 %，RSD=0.80 %，人參皂苷Re的含量平均值為0.15 %，RSD=0.84 %；人參皂苷Rb1的含量平均值為0.16 %，RSD=1.78 %；表明本法重復性良好。

中間精密度試驗：取同一批次樣品（批號：20171010）適量，按3.2項下供試品溶液制備方法，平行制備6份供試品溶液，3名人員、2臺儀器、不同日期按確定的方法進行測定，采用外標法以峰面積分別計算人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量。結(jié)果：人參皂苷Rg1的含量平均值為0.15 %，RSD=0.90 %，人參皂苷Re的含量平均值為0.16 %，RSD=0.92 %；人參皂苷Rb1的含量平均值為0.16 %，RSD=1.48 %；結(jié)果表明本方法的中間精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性試驗

取同一批次樣品（批號：20171010）適量，按制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，24 h進樣，記錄峰面積，考察供試品溶液穩(wěn)定性。結(jié)果：人參皂苷Rg1的峰面積平均值為613.74，RSD=0.10%；人參皂苷Re的峰面積平均值為423.30，RSD=0.19 %；人參皂苷Rb1的峰面積平均值為498.02，RSD=0.10 %；表明供試品溶液在24 h穩(wěn)定。

3.7 加樣回收率試驗

取本品（批號：20171010，已知樣品中人參皂苷Rg1的含量為1.58 mg/g，折0.47 mg/粒；人參皂苷Re的含量為1.48 mg/g，折0.44 mg/粒；人參皂苷Rb1的含量為1.58 mg/g，折0.48 mg/粒）40粒，研細，取約1 g，精密稱定，共6份，分別置索氏提取器中，加二氯甲烷加熱回流3 h，棄去二氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，移入250 ml圓底燒瓶，各精密加入混合對照品溶液（Rg1的濃度為0.1586 mg/ml，Re的濃度為0.1506 mg/ml，Rb1的濃度為0.1602 mg/ml）10 ml，再精密加入蒸餾水90 ml，稱定重量，按供試品制備方法制備。依法測定，結(jié)果見表2。

表2 人參皂苷Rg1、Re、Rb1加樣回收率試驗結(jié)果

Re 1 1.0024 1.480 1.506 3.001 101.02 102.10 1.76 2 1.0025 1.480 1.506 3.018 102.13 3 0.9982 1.473 1.506 3.036 103.76 4 1.0052 1.484 1.506 3.016 101.77 5 0.9994 1.475 1.506 3.047 104.41 6 1.0027 1.480 1.506 2.987 99.50 Rb1 1 1.0024 1.589 1.602 3.223 102.00 101.44 1.55 2 1.0025 1.589 1.602 3.206 100.94 3 0.9982 1.582 1.602 3.179 99.67 4 1.0052 1.593 1.602 3.256 103.80 5 0.9994 1.584 1.602 3.224 102.34 6 1.0027 1.589 1.602 3.190 99.91

結(jié)果表明，人參皂苷Rg1的平均回收率為100.48 %，RSD=1.79 %；人參皂苷Re的平均回收率為102.10 %，RSD=1.76 %；人參皂苷Rb1的平均回收率為101.44 %，RSD=1.55 %；表明方法準確度良好。

3.8 樣品含量測定

取3批參菖益智膠囊內(nèi)容物顆粒適量，按3.2項下配制供試品溶液和對照品溶液，并按3.1項下色譜條件進樣測定，采用外標法以峰面積計算膠囊中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果

結(jié)果3批樣品的含量范圍分別是人參皂苷Rg1為0.47～0.48 mg/粒，人參皂苷Re為0.44～0.45 mg/粒，人參皂苷Rb1為0.48 mg/粒，考慮人參皂苷的質(zhì)量差異，綜合本制劑復方環(huán)境，暫定含量限度見表3。

4 結(jié)論與討論

4.1 參照2015年版《中國藥典》膠囊劑項下相關的規(guī)定，對3批樣品進行了性狀、水分、裝量差異和崩解時限的檢查，結(jié)果3批樣品均符合規(guī)定。

4.2 建立了參菖益智膠囊成品中人參和石菖蒲兩味藥的薄層鑒別方法，結(jié)果供試品在與對照品或?qū)φ账幉南鄳恢蒙?，斑點均顯示相同顏色，陰性對照無干擾，方法重復性良好。

4.3 采用高效液相色譜法測定參菖益智膠囊中3種人參皂苷的含量，人參皂苷的含量測定方法雖然已有大量報道，但是大多數(shù)都是單味藥研究，復方中人參皂苷含量測定研究報道較少，通過查閱相關文獻以及反復的實驗探究，建立了參菖益智膠囊中人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Re、人參皂苷 Rb1的含量測定方法。根據(jù)方法學考察表明該方法精密度、重復性、穩(wěn)定性和加樣回收率良好，以此方法對3批樣品進行測定，結(jié)果3批樣品中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量不得少于0.40 mg/粒。結(jié)果表明，該方法簡便、重現(xiàn)性好、靈敏度高、結(jié)果準確可靠，可用于參菖益智膠囊的質(zhì)量控制。