響應(yīng)面法優(yōu)化通經(jīng)草總黃酮提取工藝

袁 哲，桑志國，孫 姍，呂元琦*

（1.濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物研究所，山東 濟(jì)南 250062；3.國家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省罕少見病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250062；4.德州學(xué)院分析測試中心，山東 德州 253023）

通經(jīng)草又名銅絲草、金絲草等，是中國蕨科粉背蕨屬銀粉背蕨[Aleuri-topteris argentea(Gmel.)Fée]的干燥全草[1]，具有活血調(diào)經(jīng)、止咳、利濕、解毒消腫等功效[2]，在我國藏族、蒙古族和朝鮮族等少數(shù)民族地區(qū)應(yīng)用較普遍。藥理研究證實(shí)通經(jīng)草具有抗炎功效，且其藥理作用主要與黃酮類組分有關(guān)[3]。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化通經(jīng)草總黃酮的超聲提取工藝，以期為該藥的研究開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV2800紫外可見分光光度計(jì)（上海佑科）；SHK-IIIS循環(huán)水式多用真空泵（鄭州科泰）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）。

1.2 材料與試劑

蘆丁對照品（國藥集團(tuán)）；亞硝酸鈉（純度＞99.0 %，天津博迪）；硝酸鋁[純度＞99.0 %，阿拉丁試劑（上海）有限公司]；氫氧化鈉（分析純，西隴化工）；無水乙醇（分析純，西隴化工）。

2 方法

2.1 通經(jīng)草總黃酮的提取工藝

將通經(jīng)草在陽光下曬干，60 ℃鼓風(fēng)干燥6 h，粉碎，過80目篩。準(zhǔn)確稱取樣品1.000 g，按一定料液比，加入一定濃度的乙醇，超聲提取一定時(shí)間，濾過，加一定濃度乙醇定容至50 ml，得黃酮粗提物備用。

2.2 測定方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取5.0 mg蘆丁對照品，置入50 ml量瓶，加60 %乙醇溶解，定容，得0.1 mg/ml對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 ml，置入9支比色管，每管加入5 % NaNO2溶液0.4 ml，搖勻，靜置6 min；加入0.4 ml 10 %硝酸鋁，搖勻，靜置6 min；加入4 % NaOH 溶液4 ml，搖勻；加入60 %乙醇定容至10 ml，搖勻，靜置15 min[3]，使用紫外分光光度計(jì)在510 nm 處測量其吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C，mg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 通經(jīng)草總黃酮含量測定 取樣品溶液5 ml，加入57 %乙醇溶液定容至10 ml，即稀釋2倍。取稀釋液1 ml，按2.2.1項(xiàng)方法測定樣品溶液在510 nm波長處吸光值。依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品溶液濃度C（mg/ml），再由以下公式計(jì)算出通經(jīng)草黃酮提取量。

通經(jīng)草總黃酮收率（%）=提取液中通經(jīng)草總黃酮含量（mg）/通經(jīng)草藥材重量（mg）×100 %

2.3 單因素考察

2.3.1 乙醇濃度對總黃酮收率的影響 準(zhǔn)確稱取通經(jīng)草細(xì)粉1.0 g，固定料液比為30:1，超聲提取75 min，考察乙醇濃度（30 %，40 %，50 %，60 %，70 %）對通經(jīng)草總黃酮收率的影響。

2.3.2 料液比對總黃酮收率的影響 準(zhǔn)確稱取通經(jīng)草細(xì)粉1.0 g，加入一定量60 %乙醇超聲提取75 min，考察料液比（15:1，20:1，25:1，30:1，35:1）對通經(jīng)草總黃酮收率的影響。

2.3.3 超聲時(shí)間對總黃酮收率的影響 準(zhǔn)確稱取通經(jīng)草細(xì)粉1.0 g，按30:1料液比加入60 %乙醇，考察超聲提取時(shí)間（30，45，60，75，90 min）對通經(jīng)草總黃酮收率的影響。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化通經(jīng)草總黃酮提取工藝

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選用乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間3個(gè)影響因素為自變量，以通經(jīng)草總黃酮收率為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3因素3水平三元二次響應(yīng)面分析方法，進(jìn)行提取條件的優(yōu)化，采用Design-Expert進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果分析。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按2.2.1項(xiàng)方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=41.596x+0.0035，R2=0.9998，表明在0.01～0.09 mg/ml范圍內(nèi)，吸光度與濃度的線性關(guān)系良好。

3.2 單因素試驗(yàn)

3.2.1 乙醇濃度對通經(jīng)草總黃酮收率的影響 結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇濃度對通經(jīng)草總黃酮收率的影響

由圖1可見，當(dāng)乙醇濃度在30 %～60 %之間時(shí)，通經(jīng)草總黃酮的提取量隨乙醇濃度的增加緩慢增大，當(dāng)乙醇濃度達(dá)60 %時(shí)，黃酮提取量迅速達(dá)到最高，之后隨著乙醇濃度提高，黃酮提取量又迅速下降。這主要是由于提取劑隨著乙醇濃度的變化其極性發(fā)生變化，只有在適當(dāng)極性下才能保證提取劑中黃酮的溶解量達(dá)最大[4]。因此，乙醇濃度為60 %時(shí)利于通經(jīng)草總黃酮的提取。

3.2.2 料液比對通經(jīng)草總黃酮收率的影響 結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對通經(jīng)草總黃酮收率的影響

由圖2可見，隨著液料比的增加，黃酮的提取量先增大后減小，當(dāng)液料比為30:1時(shí)，黃酮提取量最大。推測當(dāng)液料較小時(shí)，隨著液料比的增加，通經(jīng)草粉末與提取液的接觸面增加，黃酮類物質(zhì)向溶劑溶出的阻力減小，使得提取液中溶解的黃酮含量增加[4]。當(dāng)液料比達(dá)30:1后繼續(xù)增大，可能會(huì)因?yàn)檫^多的溶劑對超聲波產(chǎn)生一定的吸收，或因溶劑體積過大而影響傳質(zhì)過程，從而導(dǎo)致提取液中的黃酮類物質(zhì)不增反降[5]。所以30:1的液料比較適宜。

3.2.3 提超聲時(shí)間對通經(jīng)草總黃酮收率的影響 結(jié)果見圖3。

圖3 超聲時(shí)間對通經(jīng)草總黃酮收率的影響

由圖3可見，隨超聲時(shí)間的增加，通經(jīng)草總黃酮收率呈先增加后減少的趨勢，當(dāng)超聲提取時(shí)間為75 min時(shí)，總黃酮收率達(dá)最大值。這是因?yàn)辄S酮類物質(zhì)的充分溶出需要足夠的時(shí)間，但過長時(shí)間的超聲作用可能使部分黃酮類成分發(fā)生降解。因此，選擇提取時(shí)間75 min比較適宜。

3.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝結(jié)果

提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化方案及結(jié)果見表2。

表2 通經(jīng)草總黃酮提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化方案及結(jié)果

3.4 回歸方程和方差分析

以通經(jīng)草總黃酮收率為響應(yīng)值的線性回歸方程為：Y=10.27+0.06A+0.34B+0.21C-0.51AB+0.097AC-0.49BC-1.27A2-0.058B2-1.05C2。模型分析結(jié)果表明：P＜0.0001，回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)P=0.1018（P＞0.05），失擬項(xiàng)不顯著，對試驗(yàn)擬合性較好。R2=0.9961，R2Adj=0.9910，模型擬合程度較好。顯著性檢驗(yàn)表明，乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間對通經(jīng)草總黃酮收率影響顯著，影響主次順序?yàn)椋毫弦罕龋˙）＞超聲時(shí)間（C）＞乙醇濃度（A）。乙醇濃度和料液比交互項(xiàng)AB、料液比和超聲時(shí)間的交互項(xiàng)BC的P值小于0.001，表明乙醇濃度和料液比，料液比和超聲時(shí)間的交互作用對通經(jīng)草總黃酮收率有顯著影響。回歸方程分析見表3。

表3 響應(yīng)面回歸模型ANOVA分析結(jié)果

3.5 等高線和響應(yīng)圖分析

通過Design-Expert 8.0軟件對乙醇濃度（X1）、料液比（X2）、超聲時(shí)間（X3）各因子間的相互作用進(jìn)行分析，得到了圖4～圖6的響應(yīng)面和等高線圖。響應(yīng)面分析圖中，響應(yīng)面越陡峭，則該因素對響應(yīng)值的影響越顯著；相反則該因素影響不顯著。等高線圖中，可直接觀察到各影響因子交互作用強(qiáng)度，等高線接近于圓形，影響因子交互作用不強(qiáng)；相反，等高線越接近于橢圓形，說明兩個(gè)影響因子間的交互作用較強(qiáng)[5]。由圖4、圖6可見乙醇濃度（X1）與料液比（X2）、料液比（X2）與超聲時(shí)間（X3）的等高線接近于橢圓，說明乙醇濃度（X1）與料液比（X2）、料液比（X2）與超聲時(shí)間（X3）有較強(qiáng)的交互作用。由圖5可見乙醇濃度（X1）與超聲時(shí)間（X3）等高線接近于圓形，說明乙醇濃度（X1）與超聲時(shí)間（X3）交互作用較小。

通過響應(yīng)面優(yōu)化，最終確定超聲提取通經(jīng)草總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度56.91 %，料液比33.76:1，超聲時(shí)間76.79 min，響應(yīng)分析預(yù)測通經(jīng)草總黃酮收率為10.51 %，結(jié)合實(shí)際操作考慮，將提取條件調(diào)整為：乙醇濃度57 %，料液比34:1，超聲時(shí)間77 min。

圖4 乙醇濃度和料液比對總黃酮含量影響的響應(yīng)面和等高線分析圖

圖5 乙醇濃度和超聲時(shí)間對總黃酮含量影響的響應(yīng)面和等高線分析圖

圖6 料液比和超聲時(shí)間對總黃酮含量影響的響應(yīng)面和等高線分析圖

3.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

按優(yōu)化后工藝條件，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測得通經(jīng)草總黃酮的平均收率為10.19 %（RSD=0.19 %），與理論值相差僅為0.32 %，說明響應(yīng)面法得到的最佳提取工藝有較強(qiáng)的可行性。該方法優(yōu)化的通經(jīng)草總黃酮的收率亦明顯高于單變量優(yōu)化所得值（Y=9.59 %）。

4 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)，考察了乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間對通經(jīng)草總黃酮收率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙醇濃度為60 %，料液比為30:1，超聲時(shí)間為75 min時(shí)，分別達(dá)到單因素條件下通經(jīng)草總黃酮收率的最佳水平。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以通經(jīng)草總黃酮收率為指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnen中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間3個(gè)考察因素，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析法，確定提取通經(jīng)草總黃酮的最佳工藝：乙醇體積為57 %、料液比為34:1、超聲時(shí)間77 min，通經(jīng)草總黃酮收率達(dá)10.19 %。與傳統(tǒng)提取工藝相比，提高了通經(jīng)草總黃酮收率，為通經(jīng)草的開發(fā)及利用提供了理論依據(jù)。