西江肉桂揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化及抗氧化研究

馬延紅，李賽男，劉文華

(肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061)

肉桂為樟科植物肉桂(CinnamomuncassiaPresl)的干燥樹(shù)皮，是《中國(guó)藥典》收載的一味傳統(tǒng)中藥，也常作為調(diào)味品和香料使用[1]。肉桂氣香濃烈，味甜、辣，具有補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒止痛、溫通經(jīng)脈的功效[2]。肉桂通常生長(zhǎng)于熱帶、亞熱帶地區(qū)，中國(guó)作為世界桂皮的四大產(chǎn)區(qū)之一，產(chǎn)量占世界肉桂總產(chǎn)量的80%以上[3]，在世界桂皮進(jìn)出口貿(mào)易中占據(jù)重要地位[4]。中國(guó)的肉桂主要分布于廣東、廣西地區(qū)，此地出產(chǎn)的桂皮質(zhì)優(yōu)味濃，揮發(fā)油含量高，被稱為“西江肉桂”。與同類桂皮相比，西江肉桂無(wú)論是揮發(fā)油含量還是揮發(fā)油形狀和香氣，均具有極大優(yōu)勢(shì)[5]。揮發(fā)油是肉桂的主要有效成分，也是發(fā)揮生理活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。肉桂油中含有多種小分子醛類、酚類、烯類、醇類等化合物，具有濃烈的香味，并可隨水蒸氣揮發(fā)出來(lái)。桂皮醛和苯乙醛為肉桂油的主要成分，其中桂皮醛含量高達(dá)80%以上[6，7]，且肉桂醛是桂皮發(fā)揮調(diào)味作用和藥用價(jià)值的重要有效成分[8]。

水蒸氣蒸餾法具有操作簡(jiǎn)便、成本低、無(wú)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)，是目前提取肉桂油最普遍的方法[9]。水蒸氣蒸餾法的提取效率受到物料粉碎粒度、料液比、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間等多種因素影響。因此，本試驗(yàn)以桂皮為原料，采用水蒸氣蒸餾法研究不同提取條件對(duì)肉桂油提取率的影響，確定最佳提取工藝，為肉桂油的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考。同時(shí)，利用體外抗氧化試驗(yàn)測(cè)定肉桂精油的總還原能力、羥自由基清除率和DPPH清除率，評(píng)定其體外抗氧化能力。廣東肇慶作為中國(guó)肉桂的主要產(chǎn)區(qū)之一，種植面積基本保持在100萬(wàn)畝以上，產(chǎn)量占全國(guó)總產(chǎn)量的1/3[10]。提高肉桂油的加工效率和產(chǎn)量，探討其深層次研究?jī)r(jià)值，對(duì)于肉桂的合理開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

1 試驗(yàn)儀器

BSA124S-CW分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Q-800D高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 上海冰都電器有限公司；UV-6300紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；DK-98-II電爐 天津泰斯特儀器有限公司。

肉桂：產(chǎn)自廣東肇慶，購(gòu)于廣州市清平藥材市場(chǎng)；抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)于廣東光華科技股份有限公司；DPPH：購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、無(wú)水硫酸鈉、三氯乙酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、水楊酸：均購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠。

2 試驗(yàn)方法

2.1 肉桂油的提取

將桂皮適當(dāng)干燥，粉碎、過(guò)篩后置于5 L的蒸餾燒瓶中，加入浸提劑，用水蒸氣蒸餾法(依據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇不同的粉碎粒度、料液比、浸泡時(shí)間和蒸餾時(shí)間)提取肉桂油。經(jīng)水油分離、無(wú)水硫酸鈉除水后，密封保存于4 ℃冰箱中，備用。

2.2 單因素試驗(yàn)

選取不同的料液比、粉碎粒度、浸泡時(shí)間和蒸餾時(shí)間等因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

料液比的確定：準(zhǔn)確稱取25 g肉桂粉末，過(guò)20目篩，分別加入200,250,300,350 mL蒸餾水作提取溶劑，固定粉碎粒度為20目，浸泡時(shí)間為0 h，蒸餾時(shí)間為3 h，在以上條件下提取肉桂揮發(fā)油。

粉碎粒度的確定：準(zhǔn)確稱取25 g肉桂粉末，分別過(guò)20,50,60,100目篩，加入300 mL蒸餾水作提取溶劑，固定料液比為1∶12，浸泡時(shí)間為0 h，蒸餾時(shí)間為3 h，在以上條件下提取肉桂揮發(fā)油。

浸泡時(shí)間的確定：準(zhǔn)確稱取25 g肉桂粉末，過(guò)20目篩，加入300 mL蒸餾水作提取溶劑，分別浸泡0,1,2,3 h后提取，固定料液比為1∶12，粉碎粒度為20目，蒸餾時(shí)間為3 h，在以上條件下提取肉桂揮發(fā)油。

蒸餾時(shí)間的確定：準(zhǔn)確稱取25 g肉桂粉末，過(guò)20目篩，加入300 mL蒸餾水作提取溶劑，固定料液比為1∶12，粉碎粒度為20目，浸泡時(shí)間為0 h，分別蒸餾3,4,5,6 h，在以上條件下提取肉桂揮發(fā)油。

2.3 正交試驗(yàn)

利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化肉桂揮發(fā)油的提取工藝，在以上4個(gè)單因素試驗(yàn)中，選擇溶劑料液比、物料粉碎粒度、浸泡時(shí)間和蒸餾時(shí)間進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。

2.4 抗氧化活性的測(cè)定

2.4.1 DPPH法

量取不同量的揮發(fā)油于50 mL的容量瓶中，用95%乙醇將樣品配制成 0.4, 0.8, 2.0, 4.0, 8.0 mg/mL不同濃度的樣品溶液，將1 mL上述藥液加入2 mL濃度為0.5 mmol/L的DPPH 溶液，室溫遮光放置30 min，反應(yīng)完全后，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，每個(gè)試樣做3個(gè)平行樣，取平均值。用相對(duì)應(yīng)濃度的抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照組，并以抗壞血酸濃度和自由基清除率做標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品結(jié)果以每克樣品中所含抗壞血酸當(dāng)量來(lái)表示[11]。

DPPH清除率=[(A0-A1)/A0]×100%。

式中：A0為未加藥時(shí)DPPH溶液的吸光度；A1為抗壞血酸溶液或樣品溶液添加DPPH溶液的吸光度。

2.4.2 總還原能力的測(cè)定

采用鐵氰化鉀還原法[12]。取0.4,0.8,2.0,4.0,8.0 mg/mL不同濃度的肉桂揮發(fā)油溶液各1 mL加入試管中，依次加入2.5 mL的 PBS溶液和2.5 mL 1%的K3Fe(CN)6，混勻，于50 ℃恒溫水浴20 min，加入10% 三氯乙酸溶液2.5 mL，用轉(zhuǎn)速為3000 r/min的離心機(jī)離心10 min，取上清液2.5 mL，再加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，混勻，室溫放置10 min后，于700 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度，每個(gè)試樣做3個(gè)平行樣，取平均值。以與藥液同樣濃度的抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照。

2.4.3 羥自由基清除率[13]

取5支10 mL試管，分別加入0.4，0.8，2.0，4.0，8.0 mg/mL不同濃度的肉桂揮發(fā)油溶液，再依次向各試管中加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液、2 mL 6 mmol/L的H2O2溶液，搖勻后，室溫靜置10 min。再向各試管中加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，搖勻，置于50 ℃恒溫水浴30 min，于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，每個(gè)樣品測(cè)3個(gè)平行樣，取平均值。以與藥液同樣濃度的抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照，并以抗壞血酸濃度和自由基清除率做標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品結(jié)果以每克樣品中所含抗壞血酸當(dāng)量來(lái)表示。

羥自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

式中：A0為95%乙醇溶液的吸光度；A1為抗壞血酸溶液或樣品溶液的吸光度；A2為用95%乙醇代替水楊酸時(shí)樣品溶液的吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 料液比的確定

不同比例的料液比對(duì)肉桂揮發(fā)油提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同料液比對(duì)肉桂揮發(fā)油提取率的影響Fig.1 Effect of different ratios of solid to liquid onthe extraction rate of volatile oil from cinnamon

由圖1可知，料液比從1∶8到1∶14，揮發(fā)油提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且當(dāng)料液比為1∶12時(shí)，揮發(fā)油的得率最大。因此，選擇料液比1∶10、1∶12、1∶14 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

3.1.2 粉碎粒度的確定

不同粉碎粒度對(duì)肉桂揮發(fā)油提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同粉碎粒度對(duì)肉桂揮發(fā)油提取率的影響Fig.2 Effect of different crushing particle size on the extraction rate of volatile oil from cinnamon

由圖2可知，在20，50，60，100目條件下，當(dāng)粉碎粒度為50目時(shí)，揮發(fā)油得率最大。因此，選擇20，50，60目3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

3.1.3 浸泡時(shí)間的確定

揮發(fā)油提取過(guò)程中，浸泡與否及浸泡時(shí)間長(zhǎng)短會(huì)影響揮發(fā)油的得率。不同浸泡時(shí)間對(duì)肉桂揮發(fā)油提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同浸泡時(shí)間對(duì)肉桂揮發(fā)油提取率的影響Fig.3 Effect of different soaking time on the extraction rate of volatile oil from cinnamon

由圖3可知，在浸泡時(shí)間分別為0，1，2，3 h時(shí)，揮發(fā)油提取率呈先平穩(wěn)后上升再下降的趨勢(shì)，且在浸泡時(shí)間為2 h時(shí)，揮發(fā)油得率最大。因此，選擇1，2，3 h 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

3.1.4 蒸餾時(shí)間的確定

不同蒸餾時(shí)間對(duì)肉桂揮發(fā)油提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同蒸餾時(shí)間對(duì)肉桂揮發(fā)油提取率的影響Fig.4 Effect of different distillation time on the extraction rate of volatile oil from cinnamon

由圖4可知，當(dāng)蒸餾時(shí)間為3，4，5，6 h時(shí)，肉桂揮發(fā)油提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)蒸餾時(shí)間在5 h后，提取率變化不大，當(dāng)蒸餾時(shí)間為6 h時(shí)，揮發(fā)油得率最大。因此，選擇4，5，6 h 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

肉桂揮發(fā)油提取工藝因素水平見(jiàn)表1。

表1 肉桂揮發(fā)油提取工藝因素水平Table 1 Factors and levels of extraction process of volatile oil from cinnamon

表2 肉桂揮發(fā)油提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析Table 2 Orthogonal test design and results analysis of volatile oil extracted from cinnamon

以揮發(fā)油得率為指標(biāo)，由表2可知，在肉桂揮發(fā)油提取過(guò)程中，各因素對(duì)揮發(fā)油得率的影響大小依次是B>A>D>C，即料液比>蒸餾時(shí)間>粉粹粒度>浸泡時(shí)間。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，肉桂揮發(fā)油提取的最佳工藝條件是A3B2C1D3，即蒸餾時(shí)間為6 h，料液比為1∶12，浸泡時(shí)間為1 h，粉碎粒度為60目時(shí)結(jié)果最優(yōu)。結(jié)合試驗(yàn)中的揮發(fā)油提取率結(jié)果，證實(shí)了在該組合條件下，揮發(fā)油得率為4.3734%，優(yōu)于其他試驗(yàn)組合。

3.3 體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

3.3.1 清除DPPH自由基和羥自由基的能力

通過(guò)測(cè)定肉桂揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除率，評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性。研究結(jié)果表明，肉桂揮發(fā)油具有較好的體外抗氧化活性(見(jiàn)表3)。肉桂揮發(fā)油的抗氧化能力以Vc當(dāng)量來(lái)表示，在0.4,0.8,2.0,4.0,8.0 mg/mL濃度下，肉桂揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基清除率(DPPH法)用Vc當(dāng)量分別為11.4,20.9,78.9,102.3,143.2 mg/g；對(duì)羥自由基清除率用Vc當(dāng)量分別為715.0,396.9,363.9,443.8,485.7 mg/g。

表3 肉桂揮發(fā)油清除自由基能力Table 3 Free radical scavenging capacity of cinnamon volatile oil

3.3.2 總還原力的測(cè)定

總還原能力的測(cè)定是利用樣品的抗氧化性，將赤血鹽還原后，再與Fe3+作用，生成普魯士藍(lán)，以普魯士藍(lán)的生成量來(lái)表示樣品的還原能力，并以吸光度值來(lái)表示，吸光度值越高，說(shuō)明樣品的還原能力越強(qiáng)[14]。

圖5 肉桂揮發(fā)油與抗壞血酸總還原能力的比較Fig.5 Comparison of total reduction capacity ofcinnamon volatile oil and ascorbic acid

由圖5可知，肉桂揮發(fā)油的還原能力與濃度呈正相關(guān)關(guān)系，濃度越高，還原能力越強(qiáng)。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，以此來(lái)評(píng)價(jià)肉桂揮發(fā)油的總還原能力。

4 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化水蒸氣蒸餾法提取肉桂揮發(fā)油的提取工藝，最佳提取條件為：蒸餾時(shí)間為6 h，料液比為1∶12，浸泡時(shí)間為1 h，粉碎粒度為60目。在此條件下提取肉桂揮發(fā)油，出油率為4.3734%。并采用3種體外抗氧化活性檢測(cè)方法(DPPH法、羥自由基清除率、總還原能力測(cè)定)評(píng)價(jià)肉桂揮發(fā)油的抗氧化活性，結(jié)果表明：肉桂揮發(fā)油具有一定的抗氧化性，且其濃度與抗氧化活性基本呈現(xiàn)正相關(guān)性。本研究通過(guò)優(yōu)化肉桂揮發(fā)油的提取工藝，為肉桂揮發(fā)油的加工生產(chǎn)和科學(xué)合理利用提供一定的理論基礎(chǔ)。同時(shí)，肉桂不管是作為常用中藥還是日常調(diào)味品，都在人們的生活中占據(jù)重要地位。通過(guò)研究肉桂揮發(fā)油的體外抗氧化活性對(duì)于深入探究其藥用價(jià)值具有重要的科學(xué)意義。