魚類鮰愛德華菌與鮰愛德華菌病研究進展

黃 華，劉錫胤，張秀梅，王 鶴，王曉飛

(煙臺市海洋經(jīng)濟研究院,山東煙臺 264003)

自1979年美國HAWKE首次從患病斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)發(fā)現(xiàn)鮰愛德華菌(Edwardsiellaictaluri)后，在澳大利亞、泰國、越南等國先后出現(xiàn)鮰愛德華菌病報道。近年來，中國江蘇、浙江、四川、廣東、湖北、湖南、河南和重慶等省市也相繼發(fā)現(xiàn)該病[1]，受感染的魚類發(fā)病率和死亡率都很高，對魚類養(yǎng)殖構(gòu)成嚴重威脅。為了更好地防治該病，將國內(nèi)外對鮰愛德華菌與鮰愛德華菌病的研究進展進行了總結(jié)。

1 鮰愛德華菌研究進展

1.1 分類地位

鮰愛德華菌分類地位為變形菌門(Bacteria)，γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)，腸桿菌目(Enterobacteriales)，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，愛德華菌屬(Edwardsiealla)，曾被稱為愛德華氏菌“GA7752”群，有研究也將其稱為鮰愛德華氏菌或鮰魚愛德華菌[2]。鮰愛德華菌為愛德華菌中生化活性最低的1個種，尚未出現(xiàn)明顯的生物型變種[3]。鮰愛德華菌與遲緩愛德華菌(Edwardsieallatarda)在許多生化反應上相同，為區(qū)分鮰愛德華菌與遲緩愛德華菌，將其生化特性區(qū)別列于表1[3]。同時可從DNA層面進行區(qū)分，鮰愛德華菌DNA中鳥嘌呤G加胞嘧啶C克分子百分比(G+C mo1%)為53(Bd)，其模式株為ATCC33202(CDC1976278，GA7752)，而遲緩愛德華菌DNA中(G+C mo1%)為55～58(Bd)，模式菌株為ATCC15947(DSM30052)[3]。

表1 鮰愛德華菌與遲緩愛德華菌生化特性區(qū)別Tab.1 Biochemical characteristics of Edwardsiella ictaluri and Edwardsiealla tarda

注：-為0～10%陽性，[-]為11%～25%陽性，d為26%～75%陽性，+為90%～100%陽性；P為周毛。此表中的“-”是在(36±1)℃培養(yǎng)的結(jié)果；*符號為作者加注，表示該菌在約28℃培養(yǎng)時是有動力的

Notes: -: 0～10% positive，[-]: 11%～25% positive，d: 26%～75% positive，+: 90%～100% positive，P: peripheral flagellum.“-”: The results of being cultured at(36±1)℃;*: The bacteria are dynamic when cultured at about 28℃

1.2 生物學特性

鮰愛德華菌菌體短桿狀，大小為(0.8±0.2)μm×(2.5±0.5)μm，革蘭氏染色陰性，兼性厭氧，靠周生鞭毛運動，無莢膜，不形成芽孢。鮰愛德華菌在該屬細菌中屬較難培養(yǎng)的1種，在腦心浸液瓊脂(BHIA)培養(yǎng)基平板上生長較緩慢，常常需要培養(yǎng)48 h左右才能形成直徑1～2 mm、圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起的無色小菌落。愛德華菌屬其他菌種在37℃下生長良好，而鮰愛德華菌最適溫度為25℃～30℃，在37℃時生長緩慢或完全不能生長，在28℃左右時能表現(xiàn)出微弱的運動力[3]。

1.3 致病因子

近年來，學者對鮰愛德華菌致病因子研究逐漸增多。細菌的Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)與細菌毒力密切相關(guān)，參與細菌的群體感應信號調(diào)節(jié)[4]，對鮰愛德華菌全基因組測序發(fā)現(xiàn)，該菌擁有完整的T6SS編碼基因[5]，在鮰愛德華菌致病過程有重要作用[6]。EivpP是Ⅵ型分泌系統(tǒng)的主要效應蛋白之一[7]，其表達影響細菌內(nèi)化及侵入宿主細胞的過程，從而影響細菌對宿主的致病作用[8]。鮰愛德華菌的EivpP可以阻礙宿主胞漿中Ca2+的增加，使Ca2+依賴性的c-Jun N-末端激酶(JNK)無法被激活，進而影響炎癥小體接合器ASC寡聚化和效應亞基caspase-1的裂解，致使核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體激活失敗，且宿主無法分泌白細胞介素1β(IL-1β)和白細胞介素18(IL-18)。最終，EivpP通過抑制炎癥小體的激活促進鮰愛德華菌在宿主體內(nèi)的增殖[9]。

外膜蛋白(outer membrane proteins，OMPs)是革蘭氏陰性細菌外膜的主要結(jié)構(gòu)成分，其表面暴露的抗原決定簇可與宿主結(jié)合引發(fā)免疫反應，具有良好的免疫保護作用，因此許多細菌的OMPs被列入疫苗的候選成分[11-14]。通過十二烷基肌氨酸鈉(Sarkosyl)抽提并結(jié)合超速離心的方法可提取主要外膜蛋白(OMPs)。李強等[15]研究表明，黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)體內(nèi)分離的鮰愛德華菌OMPs中36 000蛋白和30 000蛋白具有很好的免疫原性，36 000蛋白尤甚。研究發(fā)現(xiàn)，ompN基因在鮰愛德華菌基因組DNA全序列中出現(xiàn)了3次，分別是ompN1、ompN2、ompN3，參與了細菌在體內(nèi)的磷酸化作用、信號轉(zhuǎn)導、糖類的轉(zhuǎn)運易位等諸多活動和功能[16]，其中位于細胞膜外表面的ompN2基因編碼的蛋白產(chǎn)物是鮰愛德華菌重要的毒力因子之一，參與細菌的致病過程[16]，且抗原表位有9個與免疫相關(guān)的抗原決定簇區(qū)域[17]。

OmpLC(outer membrane porin protein LC)作為一種特定外膜蛋白，能夠作為噬菌體ΦeiAU和ΦeiDWF的吸附受體[18]。黃艷青等[19]采用PCR方法從鮰愛德華菌基因組中擴增出外膜蛋白OmpLC基因，分析了鮰愛德華菌外膜蛋白OmpLC基因序列片段大小為1 133 bp，該基因的cDNA從32到1 111全長1 080 bp，編碼360個氨基酸，該蛋白是一種穩(wěn)定的強親水性蛋白，有信號肽，成熟蛋白無跨膜螺區(qū)，序列與OmpLC蛋白(AEQ59632、AEQ59639)具有高度同源性，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上與二者聚為一簇。

1.4 入侵魚體途徑

鮰愛德華菌侵染魚類的方式主要有3種：一是通過鼻孔(嗅球)侵入，并在嗅囊內(nèi)增殖，然后沿嗅覺神經(jīng)系統(tǒng)進入魚類腦部，導致大腦內(nèi)形成肉芽腫性炎癥，表現(xiàn)為慢性的腦膜炎[20]；二是通過胃腸壁進入魚體，隨血液循環(huán)到達魚體各個器官組織，導致魚類敗血癥，機體表現(xiàn)為急性出血癥，例如斑點叉尾鮰腸道敗血癥(enteric septicemia of catfish，ESC)[21]。BOOTH等[22]研究發(fā)現(xiàn)，鮰愛德華菌穿過腸上皮后，被巨噬細胞吞噬，一旦存活下來，就會通過血液傳播到其他組織器官，最終引起敗血癥導致魚類死亡；三是通過鰓入侵魚類。NUSBAUM等[23-24]研究發(fā)現(xiàn)，將斑點叉尾鮰浸泡在同位素標記的鮰愛德華菌中，最先在鰓上皮發(fā)現(xiàn)大量該菌，浸泡5 min后，在血液中分離出了鮰愛德華菌，后依次在肝、后腎、腸道和腦中檢測到該菌，研究發(fā)現(xiàn)，該菌能較快突破魚體屏障進入血液，并迅速擴散到全身。

2 鮰愛德華菌病流行情況與檢測方法

2.1 流行情況

鮰愛德華菌病暴發(fā)具季節(jié)性，通常發(fā)生于水溫25℃左右的春、秋季[25]。鮰愛德華菌宿主范圍較窄，主要感染鮰科魚類，例如斑點叉尾鮰[26]、北美的犀目鮰(Ameiuruscatus)[26]和黑鮰(Ameiurusmelas)[26]等，其中斑點叉尾鮰最易感染，可引發(fā)斑點叉尾鮰腸道敗血癥[27]。研究發(fā)現(xiàn)一些非鮰科魚類也被感染，例如引發(fā)黃顙魚“紅頭病”[28]，還可感染泰國蟾胡鯰(Clariasbatrachus)[29]、歐鲇(Silurusglanis)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[30]、大口黑鱸(Micropterussalmoides)、羅非魚等魚類。

2.2 檢測方法

首先通過觀察臨床癥狀，對病變情況和流行季節(jié)特點做初步診斷，然后通過微生物學檢測技術(shù)、免疫學與分子生物學等實驗手段進一步檢查，以判斷魚類是否感染鮰愛德華菌。

2.2.1 臨床癥狀觀察

魚感染鮰愛德華菌后，早期表現(xiàn)為食欲減退、游動遲緩，離群獨游、嚴重時呈“吊水”狀，頭朝上尾垂直向下懸浮，受到刺激時不停地快速旋轉(zhuǎn)或不規(guī)則游動；魚體腹部膨大，口腔、下頜、眼眶、鰓蓋、肛門及鰭條基部等部位明顯充血、出血，頭頂正中部位皮下發(fā)紅，頭背部顱側(cè)皮膚壞死、潰爛，病情嚴重的頭骨裂開暴露出腦組織[26-27]；解剖病魚可見腹腔血水或透明腹水，脂肪組織、肝、腸、腎、體腔壁有點狀或塊狀出血，腎臟、肝臟和脾臟腫大，脾臟深紅色，肝臟色淡，肝、腎組織有白色壞死灶[31-32]。

2.2.2 微生物學方法

從感染發(fā)病及死亡魚體中有規(guī)律地檢測到純一或優(yōu)勢的鮰愛德華菌，可判定為鮰愛德華菌病[3]。常從病(死)魚的腦組織、肝臟等部位分離細菌接種于血液營養(yǎng)瓊脂、腦心浸液瓊脂或普通營養(yǎng)瓊脂平板，在28℃培養(yǎng)約48 h，選取典型相應的菌落純化培養(yǎng)后進行形態(tài)特征鑒定和生化特性檢查[3]。該法是鑒定鮰愛德華菌的傳統(tǒng)方法，耗時4～6 d，不利于及時準確診斷疾病，容易延誤治療時機。龔艷清等[33]采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術(shù)可以快速、準確地檢測和鑒定該菌，鮰愛德華菌與數(shù)據(jù)庫中Edwardsiella ictaluri 885 EGS的匹配分值均在2.350～2.367之間，與EdwardsiellaictaluriDSM13697 HAM的匹配分值均在2.046～2.100之間。該方法在檢測時間、重復性、穩(wěn)定性、準確性等方面的總體表現(xiàn)都優(yōu)于傳統(tǒng)鑒定方法。

2.2.3 免疫學方法

目前檢測鮰愛德華菌的免疫學方法有間接免疫熒光檢測(indirect immunoinfluore-scence assay，IFA)、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和細菌凝集法等。有學者[34-35]制備了鮰愛德華菌的羊多克隆抗體和鯰魚抗血清，利用免疫印跡試驗，證明了鮰愛德華菌的12 kDa、18 kDa、30 kDa、34 kDa、37 kDa、60 kDa和70 kDa等7種蛋白具有強抗原性?；诖?，李強等[36-37]利用從發(fā)病黃顙魚中分離的鮰愛德華菌A86菌株為抗原，制備了6株抗鮰愛德華菌的單克隆抗體，建立了間接ELISA、競爭ELISA和免疫熒光法用于快速檢測該菌。其中間接ELISA采用37℃過夜包被方法，能有效促進酶標板對細菌的吸附作用，病原菌檢測靈敏度為5×106cells·mL-1；競爭ELISA中包被抗原5×108cells·mL-1，抗體稀釋倍數(shù)為1∶80，抗體和競爭抗原比例為3∶7，標準曲線相關(guān)系數(shù)為0.990 1，此方法特異性強，最低檢出限106cells·mL-1。李強等[38]還建立了能快速檢測鮰愛德華菌的膠體金免疫層析試紙條，靈敏度可達5×106cells·mL-1，10 min內(nèi)即可完成相關(guān)檢測，并且不需特殊儀器，結(jié)果肉眼就可判讀，適合非專業(yè)人員在基層現(xiàn)場使用，實用性強。

2.2.4 分子生物學方法

隨著分子生物學檢測技術(shù)不斷發(fā)展，在該菌鑒定中可使用16S rRNA的基因序列分析[39]，但此方法只能將該細菌鑒定到愛德華菌屬，不能鑒定到種，因為鮰愛德華菌與遲緩愛德華菌的16S-23S rRNA區(qū)間基因序列有99%的相似率[40]，因此需要幾種方法結(jié)合進行鑒定才更準確。潘延樂[41]等建立了針對鮰愛德華菌外膜微孔蛋白N基因的PCR快速檢測方法，最小核酸檢出量為9.35×10-3μg·μL-1。劉禮輝等[42]建立了多重聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)方法，可從鮰愛德華菌擴增出450 bp的目的片段，可檢測出200 CFU·mL-1的鮰愛德華菌，對臨床樣本的檢出率為100%。隗黎麗等[43]建立的鮰愛德華菌熒光定量PCR檢測方法，靈敏度為10-5μg·μL-1。

3 鮰愛德華菌病防治方法

在實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，對鮰愛德華菌病的防治主要采取以防為主、防治結(jié)合的綜合防治措施。

3.1 預防方法

3.1.1 綜合預防

首先引進魚苗和魚種時要嚴格實施檢驗檢疫，避免將帶病苗種投入池塘；其次要從優(yōu)化水質(zhì)環(huán)境[44]、保持適宜的養(yǎng)殖密度、科學飼喂入手，采取綜合預防措施，提高魚類免疫力；同時日常飼養(yǎng)管理中要操作仔細、減少應激，水溫較高時，不要拉網(wǎng)作業(yè)，不要運輸魚種。從源頭上預防或減少鮰愛德華菌病發(fā)生[45]。

3.1.2 免疫預防

采取疫苗免疫方式預防魚類感染鮰愛德華菌。針對該菌的魚類疫苗目前主要有菌蛻疫苗、滅活疫苗、微球疫苗、減毒疫苗等。王榮華等[46-47]通過誘導表達制備了鮰愛德華菌菌蛻疫苗(Edwardsiellaictalurighost，EIG)，相對免疫保護率達到89.3%。隗黎麗等[48]利用從患病黃顙魚腦部組織分離出的致病菌株JXHS制備了黃顙魚鮰愛德華氏菌的滅活疫苗，對黃顙魚的免疫保護率達到70.2%。王榮華等[49]給斑點叉尾鮰腹腔注射福爾馬林滅活的鮰愛德華菌，免疫保護率為64.3%。柳昭君等[50]采用滅活的鮰愛德華菌免疫蛋雞，通過微包膜及高速離心噴霧干燥技術(shù)制備抗鮰愛德華菌的特異性IgY功能性蛋粉，采用潑灑和口服方式，對黃顙魚免疫保護率分別為85.5%和70.0%。陽磊[51]制備了二聯(lián)口服疫苗，采用低、中、高劑量獲得鮰愛德華菌免疫保護率分別是75.0%、67.9%和60.7%。TRAN等[52]制備了2種鮰愛德華菌WZZE基因突變減毒疫苗WZM-L3(WZZE基因的1 038 bp全部敲除)和WZM-S3(WZZE基因缺失245 bp)，2種疫苗對越南鯰魚的免疫保護率(relative percent survival，RPS)分別為90.00%和89.29%。

3.2 治療方法

在養(yǎng)殖生產(chǎn)中不提倡較多地用藥，但一旦發(fā)現(xiàn)患病的魚較多或病情較重時，則要及時施藥治療。有學者通過藥敏試驗確定了鮰愛德華菌敏感的藥物有中藥和多種藥物聯(lián)合組方。藥敏試驗表明，中草藥中黃芩的抑菌作用最強，最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最低殺菌濃度分別為3.75 mg·mL-1和7.50 mg·mL-1，連翹、大黃、蒲公英、金銀花和黃柏有較強的抑菌作用，最低抑菌濃度為7.5～15.0 mg·mL-1[53]；對抗菌先鋒高度敏感，對伯樂立康、菌必清、菌毒康和海魚安中度敏感，菌必清+抗菌先鋒的聯(lián)合抗菌效果最佳[54-56]。懷疑為鮰愛德華菌病時，應盡快對病原菌進行分離鑒定，并進行體外藥敏試驗，篩選出敏感藥物進行治療。選擇治療藥物時要在水產(chǎn)養(yǎng)殖準許使用的藥物內(nèi)進行選擇，另外在發(fā)病期間，全池潑灑穩(wěn)定性二氧化氯(0.3 mg·L-1)或強氯精(0.4 mg·L-1)或漂白粉(1.0 mg·L-1)會有一定治療效果[47]。

表2 鮰愛德華菌疫苗種類Tab.2 Varieties of Edwardsiella ictaluri vaccines

表3 鮰愛德華菌敏感藥物Tab.3 The sensitive drugs of Edwardsiella ictaluri

4 結(jié)語

近年來，中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，部分從業(yè)者為追求養(yǎng)殖產(chǎn)量，過度增加養(yǎng)殖密度，忽視了疾病防控，導致養(yǎng)殖魚類鮰愛德華菌病的發(fā)生率日漸增多，隨之而來的藥物濫用、藥物殘留等現(xiàn)象屢見不鮮，對水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品帶來嚴重的質(zhì)量安全隱患。因此加強對鮰愛德華菌病原的研究，如何從源頭上預防、及時檢測、準確診斷、對癥治療顯得尤為重要。

鮰愛德華菌是對水產(chǎn)養(yǎng)殖有極大危害的病原菌，國內(nèi)外學者對該菌的致病因子、侵染方式以及對鮰愛德華菌病的治療開展了大量研究，建立了多種微生物學、免疫學及分子生物學檢測手段。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中除了采取綜合防控措施外，目前發(fā)現(xiàn)可用菌蛻疫苗、滅活疫苗、微球疫苗、減毒疫苗等免疫疫苗預防該病發(fā)生，一旦發(fā)病檢測出該病原，可使用水產(chǎn)準許的藥物對癥進行治療，同時在治療用藥過程中要注意用藥量與休藥期等問題?？咕幬锸褂貌划敚墒辜毦a(chǎn)生耐藥性，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中濫用抗生素現(xiàn)象較普遍，致使耐藥菌株大量出現(xiàn)，細菌對藥物的抗性現(xiàn)在也越來越強，用藥量應根據(jù)藥效實驗決定[53-57]。