p97蛋白在宮頸病變中的表達(dá)與臨床意義

楊文艷，賀桂芳，馬 莉，卞美璐，原亞莉，張 媛，李 純

（1.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，北京 100091；2.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029；3.清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100061；4.北京市西城區(qū)婦幼保健院，北京 100052）

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，據(jù)報(bào)道，每年全球約57 萬例新發(fā)宮頸癌患者，死亡例數(shù)達(dá)32 萬左右，其中，發(fā)展中國(guó)家占85%以上[1]。人乳頭瘤病毒（HPV）聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查是目前早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌的主要手段，但是，我國(guó)宮頸癌5年生存率僅為36.9%[2]，遠(yuǎn)低于歐美國(guó)家，主要原因是我國(guó)患者初次就診已是中晚期。因此，尋找新的檢測(cè)宮頸癌病情發(fā)展的生物標(biāo)記物成為研究熱點(diǎn)。有研究報(bào)道[3～5]，含纈氨酸蛋白p97 與結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。p97 蛋白通過控制蛋白質(zhì)質(zhì)量及調(diào)節(jié)NFγB 活性、細(xì)胞增殖、抗凋亡的過程，影響惡性腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6～8]。但p97 蛋白在宮頸癌中的研究少有報(bào)道，本研究通過檢測(cè)宮頸組織中p97 蛋白表達(dá)變化，探討其與宮頸癌的相關(guān)性及p97 蛋白表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)病情進(jìn)展及預(yù)后的臨床價(jià)值，旨在為宮頸癌的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 資料來源

選取2011年8月～2017年10月中日友好醫(yī)院婦科的手術(shù)標(biāo)本259例，其中宮頸癌組101例，年齡 （50.02±9.40）歲；CIN1 組48例，年齡為（41.27±9.26）歲； CIN2 組50例，年齡為（38.60±8.02）歲，CIN3 組40例，年齡為（42.53±10.66）歲；以同期因良性子宮疾病行子宮全切除術(shù)患者（20例）作為對(duì)照組，年齡為（42.76±7.80）歲。5 組間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

CIN1 組、CIN2 組、CIN3 組及宮頸癌組患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料完整，且術(shù)前未接受過放、化療。對(duì)照組患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）因良性子宮疾病而行子宮全切除術(shù)者，包括子宮肌瘤、子宮腺肌瘤等；（2）子宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）未見非典型鱗狀細(xì)胞或癌細(xì)胞。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前3 個(gè)月內(nèi)曾行子宮頸治療，如陰道用藥、激光治療等；（2）患者為妊娠狀態(tài)；（3）同時(shí)合并其他婦科惡性腫瘤，如子宮內(nèi)膜癌、卵巢上皮性癌等；（4）同時(shí)合并其它器官腫瘤，如腸、乳腺腫瘤等。

所取標(biāo)本均經(jīng)本院2 名病理科醫(yī)師核實(shí)。研究已通過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 免疫組化染色及評(píng)分

操作方法按試劑盒說明書，兔抗人p97 單克隆抗體（貨號(hào)：ab109204 1：200 稀釋），SP 及DAB試劑盒（貨號(hào)：ab64261）均購買自Abcam 公司。以PBS 緩沖液替代一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判定參照文獻(xiàn)，以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕色染色者為陽性細(xì)胞。高倍鏡（×400）下隨機(jī)選取5 個(gè)不同視野，5個(gè)視野平均分作為該標(biāo)本的最終得分。陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：＜5%為0 分，5%～24%為1 分，25%～49%為2 分，50%～79%為3 分，≥80%為4分；染色強(qiáng)度評(píng)分：無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分，以兩者乘積作為總分。最終得分0～3 分為弱陽性（+），4～6 分為陽性（?），7～9 分為強(qiáng)陽性（?），10～12 分為極強(qiáng)陽性（）。

1.3 HPV 檢測(cè)方法

采用熒光PCR 技術(shù)對(duì)HPV DNA 分型檢測(cè)，主要試劑及儀器包括SLAN-96 PCR 儀 （上海宏石），HR-HPV 基因分型檢測(cè)試劑盒（上海之江生物科技股份有限公司），5810R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendoff 公司）。按試劑盒操作要求進(jìn)行擴(kuò)增劑的配制和病毒核酸提取，循環(huán)參數(shù)為94℃10min； 93℃10s-62℃31s，循環(huán)40 次，單點(diǎn)熒光檢測(cè)在62℃，熒光通道選擇FAM 和VIC 通道，檢測(cè)13 種高危型HPV。

1.4 隨訪方法

101例術(shù)后病理確診的宮頸癌患者，隨訪從入院d1 開始計(jì)算，至2019年2月1日截止，總生存時(shí)間從術(shù)后d1 開始至死亡或末次隨訪時(shí)間。宮頸癌術(shù)后2年內(nèi)每3 個(gè)月復(fù)查1 次，3～5年內(nèi)每6 個(gè)月1次，第6年后每年復(fù)查1 次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0 軟件，計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以±s 表示。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)及確切概率Fisher 法。診斷試驗(yàn)采用受試者工作特征（ROC）曲線，患者累積生存率用Kaplan-Meier 單因素分析，生存率比較用log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 p97 蛋白在不同宮頸組織中的表達(dá)

對(duì)259例患者的宮頸組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示，p97 蛋白主要表達(dá)于宮頸上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，在對(duì)照組低表達(dá)，隨宮頸病變病情進(jìn)展，p97 蛋白表達(dá)水平逐漸升高，見圖1（封二）。分析不同宮頸病變組織p97 蛋白表達(dá)水平差異性，表1示，CIN 的3 個(gè)組、 宮頸癌組與對(duì)照組比較，均具有顯著性差異（均P＜0.05）。CIN3 組與宮頸癌組比較，具有顯著性差異（P＜0.05）。

將宮頸癌組織中p97 蛋白染色評(píng)分進(jìn)行匯總，以正常宮頸組織中的p97 蛋白染色評(píng)分為參照值，采用受試者工作特征（ROC）曲線，分析p97蛋白不同評(píng)分診斷宮頸癌的效能。結(jié)合SPSS 統(tǒng)計(jì)結(jié)果，A 點(diǎn)是Youden 指數(shù)最大的切點(diǎn)，其臨床意義是：p97 蛋白免疫組化染色評(píng)分為4.0 分時(shí)，p97 蛋白診斷宮頸癌的靈敏度為67.5%，特異度為65%。ROC 曲線下面積為0.720，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.055，95%可信區(qū)間為（0.613，0.828），見圖2。

2.2 p97 蛋白表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表1 p97 蛋白在不同宮頸組織中的表達(dá) n（%）

根據(jù)101例宮頸癌患者的臨床資料，結(jié)合p97 蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示宮頸癌組患者p97 蛋白表達(dá)水平與病理分化程度、 腫瘤直徑、 淋巴轉(zhuǎn)移、HPV 感染及SCC 值明顯相關(guān) （P＜0.05，P＜0.01），而與年齡、組織類型、FIGO 分期、脈管浸潤(rùn)均無關(guān)（P＞0.05），見表2。

圖2 p97 蛋白R(shí)OC 曲線

表2 p97 蛋白與宮頸癌臨床病理參數(shù)

2.3 p97 蛋白表達(dá)與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)p97 蛋白表達(dá)水平，將患者分為2 組進(jìn)行分析： 染色評(píng)分＜4 分為低表達(dá)組，≥4 分為高表達(dá)組，根據(jù)隨訪宮頸癌術(shù)后患者的情況，101例宮頸癌患者中，p97 蛋白高表達(dá)組71例，其中8例發(fā)生終點(diǎn)事件； 低表達(dá)組30例，3例發(fā)生終點(diǎn)事件，Kaplan-Meier 生存分析顯示，宮頸癌中低表達(dá)組中位生存時(shí)間估算51.55 個(gè)月，高表達(dá)組中位生存時(shí)間估算34.27 個(gè)月。2 組腫瘤患者整體上的生存曲線比較，Log-Rank 法檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量χ2=7.178，P=0.007，p97 蛋白高表達(dá)組的總生存率顯著低于p97 蛋白低表達(dá)組，見圖3（封二）。

3 討論

3.1 p97 蛋白與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系

p97 蛋白廣泛存在于人體細(xì)胞內(nèi)，與蛋白輔助因子如Npl4/Ufd1、p47、UBXD1、 泛素連接酶RNF138 等結(jié)合，參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路，影響細(xì)胞蛋白質(zhì)質(zhì)量控制、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄活性、膜融合、細(xì)胞周期調(diào)控等生理過程[9，10]。p97 蛋白是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的關(guān)鍵參與者。正常情況下，人體內(nèi)的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一些錯(cuò)誤折疊或受損的蛋白，這些殘次蛋白堆積誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，p97 蛋白介導(dǎo)泛素蛋白酶系統(tǒng)清除殘次蛋白，控制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量，維持細(xì)胞存活。而腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活更加依賴p97 蛋白。腫瘤細(xì)胞不可控性增殖分裂，產(chǎn)生大量殘次蛋白，p97 蛋白顯著激活，清除腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量殘次蛋白，與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)密切相關(guān)。Skrott 等[11]研究雙硫侖抗腫瘤機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，該藥進(jìn)入小鼠乳腺癌細(xì)胞內(nèi)，主要通過其分解物CuET 與NPL4 結(jié)合，抑制p97 蛋白發(fā)揮作用，細(xì)胞內(nèi)殘次蛋白堆積，導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。p97 蛋白還通過調(diào)控NFγB 活性發(fā)揮抗凋亡活性[8]。轉(zhuǎn)錄因子NFγB 具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，p97 蛋白與泛素化的I-γB（NFγB 的抑制蛋白）結(jié)合，將其運(yùn)輸至蛋白酶體降解，導(dǎo)致I-γB 失活，使NFγB 游離并進(jìn)入細(xì)胞核與DNA 結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)，阻止細(xì)胞凋亡。

3.2 p97 蛋白抑制劑

關(guān)于p97 蛋白抑制劑的研究，Anderson 等報(bào)道藥物CB-5083 負(fù)性調(diào)控p97 蛋白表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白的堆積，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（ERAD）途徑停滯，細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤蛋白堆積，產(chǎn)生不可逆的蛋白應(yīng)激反應(yīng)，致細(xì)胞凋亡具有抗腫瘤活性[12]。因此，p97 蛋白有望成為抗腫瘤治療的靶點(diǎn)。

3.3 p97 蛋白與婦科腫瘤的相關(guān)性

婦科腫瘤研究方面，p97 蛋白抑制劑DBeQ可與p97 蛋白結(jié)合，致卵巢癌細(xì)胞停滯于G1 期，減弱cap 依賴性翻譯，導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡[13]，推測(cè)p97 蛋白抑制劑可能抑制NFγB 活性，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。Mohammed 等[14]采用免疫組化和免疫印跡技術(shù)，檢測(cè)宮頸癌、 相鄰正常宮頸組織及CIN中p97 蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)不同宮頸病變間p97 蛋白差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。目前，國(guó)內(nèi)尚無關(guān)于p97 蛋白與宮頸癌的研究報(bào)道，我們的結(jié)果顯示p97 蛋白在宮頸癌中顯著高表達(dá)，在正常組織及癌前病變中低表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

p97 蛋白與宮頸癌細(xì)胞HPV 感染相關(guān)，但機(jī)制尚不清楚，目前研究認(rèn)為[15]，HPV 持續(xù)感染與病毒轉(zhuǎn)化基因E6、E7 的表達(dá)密切相關(guān)，位于長(zhǎng)控序列的啟動(dòng)子P97 主要調(diào)控E6、E7 基因轉(zhuǎn)錄，對(duì)病毒DNA 的復(fù)制至關(guān)重要。在體內(nèi)外，E6-E6AP 復(fù)合物通過酪氨酸磷酸酶PTPN3 調(diào)節(jié)p97 蛋白，影響宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝。本研究結(jié)果顯示，p97 蛋白與HPV 感染相關(guān)，而且，p97 蛋白表達(dá)水平隨宮頸病變進(jìn)展逐漸升高，染色評(píng)分4 分為最佳臨界值，其靈敏度67.5%，特異度65%。目前，宮頸癌的早期篩查主要依靠細(xì)胞學(xué)檢查和HPV 檢測(cè)，其中，液基細(xì)胞學(xué)檢查有效地降低了宮頸癌的死亡率[16]，但是細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)于宮頸高級(jí)別病變的診斷效能較低，存在一定的假陰性[17]，HPV 檢測(cè)能有效分類ASCUS/ASC-H，其靈敏度達(dá)86%，降低了患者的假陰性率，但是，HPV 檢測(cè)特異度較低（約31%），造成不必要的轉(zhuǎn)診[18]。p97 蛋白可能成為早期診斷宮頸癌的指標(biāo)，p97 蛋白與HPV 檢測(cè)的聯(lián)合診斷有待進(jìn)一步臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3.4 p97 蛋白表達(dá)與腫瘤預(yù)后的關(guān)系

許多研究表明，p97 蛋白高表達(dá)與惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，Yamamoto 等[3～5]報(bào)道p97 蛋白高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者具有較高的術(shù)后復(fù)發(fā)率和較低的生存率，p97 蛋白高表達(dá)的肝細(xì)胞癌具有較高的門靜脈侵犯潛能，與正常乳腺上皮相比，p97蛋白在癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)顯著增加，與乳腺癌患者總生存率下降相關(guān)。推測(cè)癌細(xì)胞產(chǎn)生大量p97 蛋白清除殘次蛋白，維持癌細(xì)胞存活，而未完全清除殘次蛋白誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，癌細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型，致使腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[19]。我們的研究顯示，p97 蛋白高表達(dá)組總生存率明顯低于低表達(dá)組，且p97 蛋白與宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，淋巴轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者中p97 蛋白高表達(dá)率為81.8%（9/11）。提示p97 蛋白可能成為檢測(cè)宮頸癌進(jìn)展的有效指標(biāo)。另外，p97 蛋白與SCC 值相關(guān)，具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，p97 蛋白與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有望成為宮頸癌早期診斷、預(yù)后評(píng)估新的分子標(biāo)記物，同時(shí)，p97 蛋白在宮頸癌組織尤其在不良預(yù)后宮頸癌中的高表達(dá)，其可能成為晚期宮頸癌治療的新靶點(diǎn)。

圖1 不同宮頸組織p97蛋白染色（HE×100）

圖3 宮頸癌中p97蛋白的生存曲線