色譜技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用

賀英 張嬌嬌 趙珺睿

天津紅日藥業(yè)股份有限公司 天津 3017 00

1 色譜技術(shù)概述

色譜分析是根據(jù)固定相和流動(dòng)相分配系數(shù)的差異對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離和分析。在液相色譜、氣相色譜和超臨界液相色譜中都可以發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相的分子聚集狀態(tài)。根據(jù)分離原理可分為吸附、分布、空間封閉、離子交換、親和性色譜。按操作原理可分為柱層析法和平板層析法，色譜分析法已成為藥典中最常用的分析方法之一。根據(jù)實(shí)際情況，使用簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)有效的儀器是必要的。隨著社會(huì)的發(fā)展，對(duì)不同藥物的檢測(cè)有很多不同的方法。不同的研究機(jī)構(gòu)或監(jiān)測(cè)部門有不同的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和要求。通過(guò)把高效液相色譜法與不同儀器相結(jié)合，使其能夠相互補(bǔ)充，進(jìn)而達(dá)到一致和實(shí)用的目的[1]。

2 常用色譜技術(shù)

2.1 高效液相色譜技術(shù)

在現(xiàn)代化學(xué)中，色譜法是一種廣泛應(yīng)用的以揮發(fā)性為主的分析分離技術(shù)。高效液相色譜法（HPLC）已成為一種更加實(shí)用有效的方法，其成為化學(xué)物質(zhì)分析和檢測(cè)的重要方法。盡管這一方法適用性強(qiáng)、效率高，但也不是萬(wàn)能的，比如其檢測(cè)器靈敏度就不如氣相色譜，不能滿足對(duì)痕量物質(zhì)的分析，比如在藥物研發(fā)中對(duì)基因毒性雜質(zhì)的控制，單采用高效液相色譜法很難滿足檢測(cè)要求。另外其柱外效應(yīng)，容易使色譜峰變寬，降低分離效率。

2.2 毛細(xì)管電泳色譜技術(shù)

毛細(xì)管電泳色譜法是1980年初開(kāi)發(fā)的一種分離技術(shù)，它將傳統(tǒng)的電泳技術(shù)與色譜法技術(shù)結(jié)合起來(lái)，具有操作方便、分離方法多樣性等優(yōu)勢(shì)?；驹瓌t是分離物質(zhì)分解成充電離子或粒子，并根據(jù)不同的運(yùn)動(dòng)或分布因素按電場(chǎng)的作用將其分離到毛細(xì)管中。近年來(lái)，毛細(xì)管電泳技術(shù)在醫(yī)療領(lǐng)域得到廣泛傳播和發(fā)展，許多國(guó)家利用毛細(xì)管電泳技術(shù)分離和測(cè)量藥物中的雜質(zhì)和異構(gòu)體[2]。

2.3 二維液相色譜技術(shù)

2.3.1 二維液相色譜技術(shù)概述

隨著現(xiàn)代藥學(xué)的發(fā)展，尤其是隨著生物技術(shù)的發(fā)展，一些復(fù)雜混合物的分離如分子肽和氨基酸等成分靠單一的色譜技術(shù)很難得到分離。二維液相色譜的出現(xiàn)，有效地促進(jìn)了現(xiàn)代藥學(xué)中復(fù)雜組分分離的進(jìn)一步發(fā)展，具有更高的分離效率。二維液相色譜（2D-LC）用于分析和檢測(cè)多種分離技術(shù)，通過(guò)把不同的色譜柱連接起來(lái)，從而使一級(jí)色譜中的非液相組在下一級(jí)二維色譜圖中能夠被分離出來(lái)。通過(guò)重復(fù)分離分析，直到所有部件分離。二維液相色譜是兩種分離方式的結(jié)合，是不同的一維液相色譜的結(jié)合，二維液相色譜可分為兩種模式：中心切割模式和二維液相色譜模式[3]。

2.3.2 二維液相色譜技術(shù)的模式

中心切割方式有選擇地將成分分為二維進(jìn)行分離和檢測(cè)，從而有效地減少外部干擾，提高分離純度。完全轉(zhuǎn)移到第二維度進(jìn)行分離。盡管存在干擾，但可獲得適用于復(fù)雜樣品分離和檢測(cè)的所有成分的進(jìn)一步信息。與一維分離檢測(cè)相比，這一檢測(cè)在極大程度上，能夠提升樣品分離的純度，進(jìn)而防止外界的干擾，簡(jiǎn)化濃縮和清洗過(guò)程，降低樣品風(fēng)險(xiǎn)。然而，分離檢測(cè)過(guò)程中的損失和污染仍然很大，因此更需要更換分離單元。

通常情況下，對(duì)于二維液相色譜而言，往往使用兩支或多支色譜柱，再者，根據(jù)柱結(jié)合技術(shù)，進(jìn)一步完成樣品的柱間切換。一般而言，柱切換分為部分和整體兩種。這種劃分主要是根據(jù)切割組分來(lái)進(jìn)行，根據(jù)其是否直接進(jìn)入二維中，然而，二維分離可分為離線和在線。對(duì)于以往的中心切割技術(shù)，首先是在容器中收集一維洗脫產(chǎn)物，然后進(jìn)樣到第二維中?，F(xiàn)階段，隨著社會(huì)的進(jìn)步以及經(jīng)濟(jì)水平的不斷提升，相應(yīng)的儀器也得到快速的發(fā)展，以便能夠有效適應(yīng)自動(dòng)化分離的需要[4]。

2.4 液相色譜-核磁共振聯(lián)用技術(shù)

對(duì)于核磁共振而言，其獲得有機(jī)物詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息的有力手段，在極大程度上，可以提供不同分子間的細(xì)微差別，然而，核磁共振主要是分析樣品是否為純物質(zhì)，如果對(duì)混合物加以研究，往往是比較有難度的?；谶@一現(xiàn)狀，在運(yùn)用核磁共桭時(shí)，應(yīng)該對(duì)混合樣品進(jìn)行分離，以便達(dá)到顯著的效果。液相色譜-核磁共振技術(shù)始于上世紀(jì)80年代，是近年來(lái)才發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。液相色譜-核磁共振技術(shù)主要應(yīng)用于然產(chǎn)物的分析及藥物的代謝研究，但其普及度不高，在實(shí)際運(yùn)用中還存在著一些不足，比如NMR檢測(cè)靈敏度不夠高，液相色譜中流動(dòng)相中的質(zhì)子對(duì)NMR的干擾等問(wèn)題。相信今后隨著技術(shù)的發(fā)展，色譜-核磁共振連用技術(shù)會(huì)有質(zhì)的發(fā)展，在藥物分析領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用，通過(guò)參考文章《液相色譜-核磁共振連用技術(shù)發(fā)展?fàn)顩r》得出。

2.5 分子生物色譜技術(shù)

這一技術(shù)具有重現(xiàn)性好、分析速度快、具有藥理學(xué)意義等特點(diǎn)，適用于中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的篩選研究。

2.5.1 血漿蛋白

血漿蛋白能與藥物發(fā)生可逆結(jié)合成為“血漿蛋白-藥物復(fù)合物”，到達(dá)作用部位發(fā)生藥理作用。將血漿蛋白固載于載體上作為生物色譜填料，形成一種可以模擬體內(nèi)環(huán)境中藥物與血漿蛋白間相互作用的色譜系統(tǒng)，由于不同的藥物分子與血漿蛋白的結(jié)合率具有差異，它在固定相的保留行為也不同，結(jié)合色譜技術(shù)中的各種參數(shù)計(jì)算，一方面可以篩選中藥中的活性物質(zhì)，還能進(jìn)行藥物與血漿蛋白的作用關(guān)系的研究[6]。

2.5.2 受體類

受體是一類功能蛋白，是藥物發(fā)揮作用的主要靶點(diǎn)，通過(guò)受體特異性地識(shí)別、結(jié)合，通過(guò)信息傳導(dǎo)從而參與生理調(diào)控、神經(jīng)傳導(dǎo)等多種機(jī)體生理病理過(guò)程。若將受體固載于固定相表面，把其特異性結(jié)合作用與色譜分離技術(shù)結(jié)合，就能建立一種快速篩選藥效物質(zhì)的方法，在此色譜柱中可保留能與受體特異性結(jié)合的中藥活性組分，而無(wú)保留行為的物質(zhì)流出，活性篩選和色譜分離兩種模式可同時(shí)進(jìn)行。基于高親和力固定化受體的色譜法有望成為確認(rèn)藥物靶標(biāo)和藥物受體相互作用分析的替代方法。

2.5.3 DNA

DNA是很多藥物的作用靶點(diǎn)如抗菌、抗腫瘤、抗病毒等，藥物小分子可與DNA通過(guò)嵌插作用、溝槽結(jié)合、靜電結(jié)合、長(zhǎng)距組裝等相結(jié)合，由于溝槽結(jié)合和嵌插不會(huì)影響DNA的結(jié)構(gòu)而影響其活性，因此DNA通過(guò)上述方式構(gòu)建MBC，以此篩選天然產(chǎn)物中的活性物質(zhì)。Su等以小牛胸腺DNA為固定相，作為一維色譜分離黃連、黃柏和苦參中的活性成分，而為二維色譜ODS柱色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)，對(duì)一維色譜的粗產(chǎn)物進(jìn)行分離分析鑒定，實(shí)現(xiàn)了中藥復(fù)雜樣品的高效分離和活性成分篩選鑒定一體化流程[7]。

3 結(jié)語(yǔ)

色譜技術(shù)在醫(yī)藥產(chǎn)品的檢測(cè)和分離中起著非常重要的作用。在藥品的實(shí)際檢測(cè)中，應(yīng)根據(jù)樣品的種類、純度要求和分離的需要，選擇合適的分離技術(shù)和類型[8]。