高效液相色譜法檢測化妝品中的番茄紅素

白洋

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350002）

番茄紅素(Lycopene)是自然界中的一種類胡蘿卜素，主要存在于番茄、蘿卜、西瓜等植物中，是自然界中已知的最強(qiáng)抗氧化劑之一，其清除單線態(tài)氧的能力是維生素E的100倍，同時有研究表明番茄紅素具有抗氧化、抗癌、抗炎、降血脂等多種生物活性[1-6]。

隨著人民的生活水平不斷提高，化妝品已經(jīng)成為生活中不可或缺的一部分，而具有抗衰老，抗污染等功效的化妝品更加受到人們的重視。番茄紅素作為化妝品中一種功能性成分，已有研究表明其在化妝品中能夠發(fā)揮多種功效。如抗衰老作用：實(shí)驗(yàn)表明番茄紅素能夠發(fā)揮清除自由基的作用，降低自由基對皮膚的影響，達(dá)到延緩衰老的目的[7-9]；防紫外線損傷作用：番茄紅素對紫外線誘導(dǎo)的 HLEC細(xì)胞的氧化損傷具有一定的抑制作用，同時還有UV拮抗作用，能夠降低紫外線對皮膚的損傷[10-11]；油脂穩(wěn)定劑作用：番茄紅素的抗氧化能力能夠使其充當(dāng)化妝品中的油脂穩(wěn)定劑，從而能夠減少有致癌性的二丁基羥基甲苯(BHT)以及丁基羥基茴香醚(BHA)的用量[12-13]；天然著色劑作用：番茄紅素鮮艷的顏色使其可以應(yīng)用于口紅等化妝品中充當(dāng)著色劑的角色。以上的諸多功效使得番茄紅素在化妝品中有著廣泛的應(yīng)用前景。

目前在《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）以及歐盟化妝品法規(guī)（EC）No1223/2009中番茄紅素均列為允許添加項(xiàng)目，且對其沒有限量要求，但并未給出相應(yīng)檢測方法。同時對國內(nèi)外文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的番茄紅素檢測方法和手段僅限于食品、保健品領(lǐng)域，對于化妝品中的番茄紅素檢測還未見相關(guān)文獻(xiàn)報道和標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布。為此，進(jìn)行化妝品中番茄紅素的檢測技術(shù)開發(fā)，對于加強(qiáng)化妝品品質(zhì)的管理，維護(hù)消費(fèi)者的權(quán)益，有著深遠(yuǎn)的意義。

目前對番茄紅色的檢測方法大多采用高效液相色譜法[14-17]、液質(zhì)聯(lián)用法[22-24]，研究主要集中在食品、保健品等領(lǐng)域，無法滿足化妝品中番茄紅素的檢測需求。本文針對化妝品中番茄紅素，采用C30柱進(jìn)行梯度洗脫分離，以甲醇-叔丁基甲基醚為流動相，經(jīng)高效液相色譜法分離進(jìn)行檢測，從而建立了高效、準(zhǔn)確、快速、靈敏的化妝品中番茄紅素分離檢測的技術(shù)，為化妝品中番茄紅素的檢測、應(yīng)用和監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters2695高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；

渦旋混合器（江蘇健康醫(yī)藥公司）；

Avanti J-E 高速冷凍離心機(jī)（美國貝克曼公司）；

分析天平（感量為0.1 mg，賽多力科（北京）科學(xué)有限公司）。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水；甲醇（色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司），二氯甲烷、石油醚（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），叔丁基甲基醚（色譜純，德國CNW公司），番茄紅素（95%）購于加拿大TRC公司。

0.20 μm PTFE膜購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司，0.45 μm尼龍66膜購于天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液和工作溶液配制

番茄紅素儲備液：稱取適量番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷(含有0.1%BHT)溶解并定容至刻度線，配制成100 mg/L儲備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：將儲備液用二氯甲烷(含有0.1%BHT)稀釋成濃度從0.08 mg/L到4.00 mg/L之間的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，標(biāo)準(zhǔn)儲備液和系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液均置于冰箱中-20 ℃溫度下保存。

房地產(chǎn)市場的繁榮，使住宅工程項(xiàng)目遍地開花，但由于編制的限制，部分地區(qū)質(zhì)量監(jiān)督機(jī)構(gòu)每2人的監(jiān)督小組需要承擔(dān)十幾個甚至更多項(xiàng)目的監(jiān)督工作，嚴(yán)重超出承受能力，無法對每一個項(xiàng)目進(jìn)行細(xì)致的監(jiān)管。

1.3 樣品前處理

1.3.1 口紅類固體樣品

稱取試樣1.0 g（精確至0.0001 g）于50 mL螺紋蓋離心管中，用玻璃棒均勻涂抹在離心管內(nèi)部，加入20 mL含有0.1%BHT的二氯甲烷渦旋溶解分散樣品，震蕩提取3 min，經(jīng)10000 r/min離心5 min后，取二氯甲烷層轉(zhuǎn)移至棕色圓底燒瓶，重復(fù)用20 mL上述溶液提取一次，合并2次提取液，旋轉(zhuǎn)至近干，用含有0.1%BHT的二氯甲烷定容至5 mL。過0.20 μm PTFE濾膜，濾液供液相色譜測定。

1.3.2 面霜類半固體樣品

稱取試樣2.0 g（精確至0.0001 g）于50 mL螺紋蓋離心管中，加入20 mL含有0.1%BHT的二氯甲烷渦旋溶解分散樣品（如樣品結(jié)塊無法分散，加入適量水使樣品分散后，再加入含有0.1%BHT二氯甲烷萃取），震蕩提取3 min，經(jīng)10000 r/min離心5 min后，取二氯甲烷層轉(zhuǎn)移至棕色圓底燒瓶，重復(fù)用20 mL上述溶液提取一次，合并2次提取液，旋轉(zhuǎn)至近干，用含有0.1% BHT的二氯甲烷定容至5 mL。過0.20 μm PTFE濾膜，濾液供液相色譜測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：XB-C30柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，美國Welch公司）。

流動相：甲醇（A）-叔丁基甲基醚（B）。

洗脫梯度程序：0～15 min，60%～50% A；15～15.1 min，50%～60% A；15.1～20 min，60% A。

流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；

檢測器：光電二極管陣列檢測器；檢測波長：475 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

光電二極管陣列檢測器在300 ～600 nm范圍內(nèi)對番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行掃描，如圖1所示，目標(biāo)物的最大吸收波長475 nm。因此選擇475 nm作為番茄紅素的檢測波長。

圖1 番茄紅素的最大吸收波長

2.2 色譜條件優(yōu)化

比較了Ultimate XB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、CNW Athena C18-WP (4.6 mm×250 mm，5 μm)和Ultimate XB-C30 (4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱對番茄紅素的分離效果，結(jié)果如圖2所示。相較于CNW Athena C18-WP（圖2B）柱和Ultimate XBC18（圖2C）柱，番茄紅素在Ultimate XB-C30柱上有著最好的分離效果，峰形更加對稱（圖2A），同時還有研究表明C30色譜柱在分離類胡蘿卜素化合物時有著一定的優(yōu)勢[21]，因此本實(shí)驗(yàn)選用XB-C30柱作為分離色譜柱。

圖2 不同色譜柱對番茄紅素的分離比較

實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-甲醇、甲醇-二氯甲烷和甲醇-叔丁基甲基醚3種流動相體系的分離效果，結(jié)果表明在乙腈-甲醇流動相體系下番茄紅素?zé)o法被洗脫，甲醇-二氯甲烷、甲醇-叔丁基甲基醚流動相體系對番茄紅素均有良好的分離效果，考慮到二氯甲烷相較于叔丁基甲基醚毒性較大，因此本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇-叔丁基甲基醚作為流動相體系。

2.3 樣品前處理的優(yōu)化

考察水、二氯甲烷、石油醚對面霜和口紅樣品的分散溶解情況。結(jié)果表明，二氯甲烷或石油醚對口紅以及大部分面霜均有著良好的溶解分散作用，但一定量的溶劑只能分散溶解適量的樣品，通過考察不同用量的溶劑對上述樣品的分散溶解情況，結(jié)果表明用量在20 mL以上能使得1.0 g的口紅和2.0 g的面霜樣品能完全分散溶解；部分面霜在二氯甲烷和石油醚中無法分散，需要加入適量水進(jìn)行溶解后，再進(jìn)行萃取。

進(jìn)一步考察20 mL的二氯甲烷和石油醚提取體系對口紅、面霜加標(biāo)樣品中番茄紅素的提取效率，結(jié)果顯示，用20 mL的二氯甲烷提取2次，其回收率為93.5%～98.3%；而石油醚提取提2次后回收率僅在70%左右，因本實(shí)驗(yàn)選擇二氯甲烷溶液進(jìn)行提取。考慮到番茄紅素的不穩(wěn)定性，在前處理過程中均避光操作，并在二氯甲烷（石油醚）中在加入0.1%BHT。

同時考察了不同材質(zhì)的濾膜對番茄紅素的影響情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，尼龍66膜對番茄紅素有著一定的影響，通過率在90%左右，而PTFE膜對番茄紅素的通過率在95%以上，因而選擇PTFE膜進(jìn)行樣品過濾操作。

表1 番茄紅素的線性方程、線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限

表2 空白基質(zhì)樣品中番茄紅素平均加標(biāo)回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

配制混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以各分析物的峰面積（Y）對相應(yīng)的質(zhì)量濃度（X，mg/L） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。番茄紅素的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限（信噪比S/N =3）及定量限（S/N = 10）見表1。結(jié)果表明，在目標(biāo)物質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，番茄紅素的含量與峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）不小于0.9999，定量限分別為0.13 μg/g、0.065 μg/g。

2.5 回收率和精密度

以空白基質(zhì)樣品進(jìn)行3個水平加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，在優(yōu)化后的測試條件下，每個水平平行測定6 次，平均加標(biāo)回收率為93.5%～98.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%～3.0%（見表2）。結(jié)果表明，該方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，可用于化妝品中直接染料的日常分析檢測。

2.6 實(shí)際樣品分析

采用本文建立的分析方法對市售的12份化妝品進(jìn)行分析，均未檢出番茄紅素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確、快速、可靠，可應(yīng)用于實(shí)際大批量樣品的快速分析。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜法可同時分離、檢測化妝品中的番茄紅素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法簡便快速，靈敏度高，定量準(zhǔn)確可靠，適用于化妝品中番茄紅素的同時分析檢測。