全身性機械振動載荷修復(fù)2型糖尿病皮膚軟組織創(chuàng)傷的實驗研究

吳 敏，邵 希，景 達，葛淑華*

（1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西安 710032；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系，西安 710032）

0 引言

2型糖尿?。ㄓ址Q成人發(fā)病型糖尿病）是臨床上最為常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，患病人數(shù)占臨床糖尿病總患病人數(shù)的90%，而且隨著我國人口老齡化進程的加劇，呈現(xiàn)出逐年遞增的趨勢[1-2]。2型糖尿病患者的創(chuàng)傷愈合障礙是最為常見且最棘手的臨床并發(fā)癥之一。2型糖尿病患者中糖尿病潰瘍的發(fā)生率約為25%，而這其中的70%在進行治療后的半年其創(chuàng)口仍難以充分愈合[3]。正常組織的損傷修復(fù)涉及到炎性反應(yīng)、組織新生、血管再生和組織塑形重建等階段，而2型糖尿病對于上述各修復(fù)階段均產(chǎn)生顯著的破壞效應(yīng)，導(dǎo)致創(chuàng)傷組織延遲愈合[4]。糖尿病的創(chuàng)傷愈合障礙對2型糖尿病患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生了較大影響，并顯著提高了2型糖尿病的致殘率和致死率。

在創(chuàng)傷的修復(fù)過程中，局部的力學(xué)因素對于傷口位置的細胞和組織新生發(fā)揮重要作用[5]。而通過外源性地施加力學(xué)手段加速組織創(chuàng)傷修復(fù)也有大量的文獻報道[6-7]。近年來，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)低強度（<0.5g）、高頻率（30~100 Hz）的周期性全身機械振動載荷（whole-body vibration，WBV）刺激能夠顯著加速骨折愈合修復(fù)并對抗骨質(zhì)疏松[8-9]。同時，學(xué)者們也發(fā)現(xiàn)了WBV刺激能夠顯著加速皮膚的創(chuàng)傷愈合進程，改善軟組織的損傷修復(fù)能力[10-11]。但是，周期性的WBV刺激是否能夠改善糖尿病（尤其是占比最多、危害最大的2型糖尿?。┑膭?chuàng)傷愈合障礙，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)的文獻報道。本研究中使用2型糖尿病的db/db小鼠作為研究對象，系統(tǒng)探究周期性的WBV刺激對其創(chuàng)傷修復(fù)速率、軟組織抗張強度、組織病理性特征以及炎性和血管再生相關(guān)細胞因子表達的影響，旨在系統(tǒng)闡明周期性WBV刺激對于2型糖尿病皮膚損傷修復(fù)的改善效果及初步干預(yù)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

戊巴比妥鈉麻醉液，購于美國Sigma公司；便攜式血糖儀，購于美國Johnson公司；Tegaderm透明傷口敷料，購于美國3M Health Care公司；生物組織力學(xué)測試系統(tǒng)，購于東莞昆侖檢測儀器有限公司；數(shù)碼照相機，購于日本Canon公司；高斯計，購于美國Lakeshore公司；組織切片機，購于德國Leica公司；ELISA試劑盒，購于武漢華美生物工程有限公司；周期性WBV加載系統(tǒng)，課題組自制；WBV強度測量儀，購于上海星晟檢測儀器有限公司。

1.2 實驗分組和皮膚創(chuàng)傷模型建立

3月齡雄性db/db小鼠（C57BKS背景，BKS.Cgm+/+Leprdb/J）及與其同背景的野生型小鼠，購于美國Jackson實驗室。全部動物飼養(yǎng)于溫度（22~24℃）、相對濕度（50%~60%）和光照（12 h/12 h光-暗循環(huán)）精確可控的動物實驗室中。待充分適應(yīng)環(huán)境一周后，通過尾靜脈取血（清晨取樣），使用便攜式血糖儀測量db/db小鼠隨機血糖值，血糖值高于16.7 mmol/L的小鼠被納入本實驗。整個實驗共分3組：Wild type野生型小鼠組（Control組）、db/db小鼠組（db/db組）及db/db協(xié)同以周期性WBV刺激組（db/db+WBV組），每組均為16只小鼠。于全部3組小鼠背部構(gòu)建軟組織創(chuàng)傷模型，實驗步驟：腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，使用皮膚活檢針在小鼠背部構(gòu)建直徑1 cm的圓形傷口，充分分離皮膚、皮下組織和肌纖膜組織，并覆蓋以Tegaderm傷口敷料以保持傷口濕潤。術(shù)后注射青鏈霉素合劑預(yù)防傷口感染。分別于軟組織創(chuàng)傷模型建立后的第5、12、19天處死每組4只小鼠，每組剩余的4只小鼠用于觀察傷口完全愈合所需時間。db/db+WBV組小鼠在創(chuàng)傷模型構(gòu)建后立即施以周期性WBV刺激，每天治療2次（間隔8 h），每次30 min。本研究中的動物實驗操作全部由空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物倫理學(xué)委員會授權(quán)批準。

1.3 周期性WBV刺激

使用課題組自行設(shè)計研制的周期性WBV刺激系統(tǒng)對db/db小鼠施加周期性WBV刺激。在WBV刺激過程中，小鼠被放置于實驗籠中，實驗籠置于尺寸為 30 cm×30 cm×30 cm（長×寬×高）的 WBV 刺激平臺上。WBV刺激平臺由一個電磁式機械促動器驅(qū)動，該促動器與功能發(fā)生器相連，在動物身上產(chǎn)生垂直方向的振動動作。將WBV強度測量儀與WBV刺激平臺緊密相連，對傳遞給小鼠的機械信號進行檢測。WBV刺激平臺以正弦波形向db/db小鼠施加周期性WBV刺激，垂直加速度為0.5g，頻率為45 Hz。Control組和db/db組的小鼠同樣放置于WBV刺激平臺上，但不施以WBV刺激。

1.4 傷口閉合率的檢測分析

分別于皮膚損傷術(shù)后的第0、5、12、19天使用數(shù)碼照相機拍攝小鼠背部傷口愈合情況。使用戊巴比妥鈉麻醉每組4只小鼠并將其固定于觀察臺上，然后將數(shù)碼照相機置于小鼠正上方20 cm處對傷口進行拍攝。使用課題組自行編制的MATLAB程序?qū)趫D片進行自動識別（基于顏色閾值、邊緣提取等圖像分析算法）并對傷口面積進行量化分析。以創(chuàng)傷愈合率作為評估傷口愈合情況的標準，創(chuàng)傷愈合率以第0天與第n天的傷口面積之差除以第0天傷口面積表示[12]。

1.5 傷口組織抗張強度檢測分析

分別于皮膚損傷術(shù)后的第5、12、19天處死各組動物后，迅速提取傷口及周圍軟組織樣本，并將其修剪成8 mm×8 mm的方形條帶。隨后將方形條帶置于生理鹽水溶液中以避免組織力學(xué)性能發(fā)生變化。采用生物力學(xué)材料測試系統(tǒng)進行組織拉伸試驗：皮膚條固定在張力計的2個夾子之間，傷口部位位于2個夾子的中線處。通過2個夾鉗的移動（速度20 mm/min）向條帶施加拉力。當觀察到試樣最終破裂時，記錄此時的載荷，即為最大斷裂載荷。

1.6 傷口組織病理染色和ELISA檢測分析

取傷口附近的用于生物力學(xué)測試剪裁后剩余的軟組織，尺寸約為5 mm×3 mm，將其固定于10%中性福爾馬林中，隨后進行石蠟包埋，用鋸片切片機切割為5 μm厚的切片。切片脫皮復(fù)水，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察載玻片。ELISA檢測使用武漢華美生物工程有限公司的ELISA商業(yè)試劑盒，檢測指標分別為白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血管生成素（Ang1），所有操作嚴格按照試劑盒的說明執(zhí)行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)檢驗分析

本實驗中所涉及的數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標準差的形式表示，使用Microsoft SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的分析。使用Kolmogorov-Smirnov檢驗進行正態(tài)分布檢驗及使用Levene檢驗進行方差齊性評價的基礎(chǔ)上，采用單因素方差分析（ANOVA）評價3組間差異的存在性。如果檢測到顯著性差異，則采用Bonferroni分析來確定每兩組之間差異的顯著性。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 周期性WBV刺激對2型糖尿病db/db小鼠血糖和體質(zhì)量的影響

Control、db/db、db/db+WBV 3 組小鼠在皮膚組織創(chuàng)傷模型建立后的第5、12、19天的體質(zhì)量和血糖水平如圖1所示。與Control組小鼠相比，db/db組小鼠和db/db+WBV組小鼠在術(shù)后各時間點的體質(zhì)量和血糖值均顯著升高（P<0.01）。但是，db/db組小鼠與db/db+WBV組小鼠在術(shù)后的第5、12、19天的體質(zhì)量和血糖值均無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)果表明，周期性WBV刺激對2型糖尿病db/db小鼠的體質(zhì)量和血糖未產(chǎn)生顯著影響。

圖1 周期性WBV刺激對db/db小鼠體質(zhì)量和血糖的影響

2.2 周期性WBV刺激對2型糖尿病db/db小鼠創(chuàng)傷愈合率和總愈合時間的影響

Control、db/db、db/db+WBV 3 組小鼠在皮膚組織創(chuàng)傷模型建立后的第5、12、19天的創(chuàng)傷愈合率如圖2（a）所示。db/db 組小鼠在術(shù)后的第 5、12、19 天的創(chuàng)傷愈合率均顯著低于Control組（P<0.01，在術(shù)后第5、12、19天分別減少了54.2%、35.2%和30.1%），提示db/db小鼠表現(xiàn)出典型的創(chuàng)傷愈合障礙。與db/db組相比，db/db+WBV組小鼠在皮膚組織創(chuàng)傷模型建立后的第5、12、19天的創(chuàng)傷愈合率顯著升高（P<0.05，在術(shù)后第 5、12、19 天分別增加了 92.0%、31.1%和23.5%）。3組小鼠的創(chuàng)傷總愈合時間如圖2（b）所示。db/db組小鼠相比于Control組創(chuàng)傷總愈合時間增加了74.2%（P<0.01），但db/db+WBV組小鼠的創(chuàng)傷愈合時間較db/db組小鼠減少了27.6%（P<0.05）。

圖2 周期性WBV刺激對db/db小鼠創(chuàng)傷愈合率和總愈合時間的影響

2.3 周期性WBV刺激對2型糖尿病db/db小鼠傷口組織抗張強度的影響

Control、db/db、db/db+WBV 3 組小鼠在皮膚組織創(chuàng)傷模型建立后的第5、12、19天的傷口組織抗張強度如圖3所示。與Control組相比，db/db組小鼠在術(shù)后各時間點的傷口組織抗張強度均顯著降低（P<0.01，術(shù)后第5、12、19天分別減少了52.6%、44.9%和44.0%）。周期性WBV刺激在術(shù)后的第5、12、19天均顯著增加了db/db組小鼠傷口組織的抗張強度（P<0.05，術(shù)后第 5、12、19天分別提高了 54.8%、32.0%和42.3%）。

圖3 周期性WBV刺激對db/db小鼠傷口組織抗張強度的影響

2.4 周期性WBV刺激對2型糖尿病db/db小鼠傷口組織病理學(xué)的影響

Control、db/db、db/db+WBV 3 組小鼠在皮膚組織創(chuàng)傷模型構(gòu)建第12天的傷口組織病理性染色結(jié)果如圖4所示。db/db組小鼠的組織創(chuàng)傷位置在術(shù)后的第12天仍可見眾多炎性細胞聚集，Control組小鼠的組織創(chuàng)傷位置的炎性細胞數(shù)量較少，而經(jīng)周期性WBV刺激12 d后db/db組小鼠的組織創(chuàng)傷位置的炎性細胞數(shù)量顯著減少。

圖4 術(shù)后第12天周期性WBV刺激對2型糖尿病db/db小鼠傷口組織影響的病理性染色結(jié)果（HE，40×）

2.5 周期性WBV刺激對2型糖尿病db/db小鼠傷口組織中重要細胞因子表達的影響

Control、db/db、db/db+WBV 3 組小鼠在皮膚組織創(chuàng)傷模型建立后的第5、12、19天的傷口組織中重要細胞因子表達情況如圖5所示。與Control組相比，db/db組小鼠在皮膚組織創(chuàng)傷模型建立后的第5、12、19天的促炎性因子IL-1β和TNF-α表達量顯著升高（P<0.01），同時db/db組小鼠的血管新生相關(guān)的細胞因子VEGF和Ang1的表達量在術(shù)后的各時間點也顯著低于Control組小鼠（P<0.01）。db/db+WBV組小鼠在皮膚組織創(chuàng)傷模型建立后的第5、12、19天的IL-1β和TNF-α表達量顯著低于db/db組（P<0.05），而VEGF和Ang1的表達量顯著高于db/db組（P<0.05）。

圖5 通過ELISA檢測周期性WBV刺激對db/db小鼠傷口組織中重要細胞因子表達的影響

3 討論

美國Rubin教授于2001年首次提出了外源性的周期性WBV刺激能夠顯著增加機體的骨量，提高骨骼力學(xué)強度[13]。而隨后的大量動物實驗和臨床研究均發(fā)現(xiàn)，WBV刺激能夠?qū)构琴|(zhì)疏松骨丟失進程并加速骨折的延遲愈合[8-9]。與骨組織類似，皮膚組織的損傷修復(fù)同樣需要力學(xué)信號的參與，而WBV刺激同樣被證實能夠顯著加速皮膚的創(chuàng)傷愈合及改善軟組織的自修復(fù)能力[10-11]。但是，WBV刺激是否能夠加速糖尿病（尤其是最為常見的2型糖尿?。┑能浗M織損傷修復(fù)，目前尚不得而知。瘦素受體缺陷的db/db小鼠是目前最為常見的用于2型糖尿病研究的實驗動物模型，它能夠表現(xiàn)出典型的多飲、多食、多尿、高血糖等2型糖尿病體征，這一動物模型也已被廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的各種并發(fā)癥的病因?qū)W和治療學(xué)研究[14-16]。在本實驗中，同樣發(fā)現(xiàn)了db/db組小鼠的體質(zhì)量和血糖值顯著高于Control組小鼠，但是周期性WBV刺激并未對db/db組小鼠的體質(zhì)量和血糖產(chǎn)生顯著影響，表明周期性WBV刺激并未對db/db小鼠的糖尿病體征產(chǎn)生明顯的調(diào)控作用。

軟組織的創(chuàng)傷修復(fù)是一個由炎性細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞等共同作用的復(fù)雜過程，包括炎癥反應(yīng)期、組織增生和肉芽形成期、傷口塑形重建期3個主要階段，而2型糖尿病能夠?qū)ι鲜龈麟A段產(chǎn)生顯著的破壞效應(yīng)，導(dǎo)致2型糖尿病的創(chuàng)傷延遲愈合或不愈合[17]。本研究結(jié)果顯示，db/db組小鼠在組織創(chuàng)傷模型構(gòu)建的第5、12、19天的創(chuàng)傷愈合率均顯著低于非糖尿病的Control組小鼠，且db/db組小鼠的傷口閉合時間也顯著長于Control組小鼠，進一步證實了2型糖尿病db/db小鼠表現(xiàn)出顯著的傷口延遲愈合特性。而研究中也發(fā)現(xiàn)周期性WBV刺激從術(shù)后第5天即顯現(xiàn)出對db/db小鼠傷口愈合修復(fù)的積極作用，且這種積極的作用效果一直持續(xù)至創(chuàng)傷修復(fù)的全過程。

軟組織的生物力學(xué)抗張強度是一個能夠反映傷口組織修復(fù)質(zhì)量的關(guān)鍵指標，其與組織中的膠原數(shù)量和排列質(zhì)量呈正相關(guān)關(guān)系[18-19]。本研究結(jié)果顯示，2型糖尿病db/db組小鼠在創(chuàng)傷模型構(gòu)建的第5、12、19天的創(chuàng)傷愈合修復(fù)速率均顯著低于Control組小鼠，提示2型糖尿病顯著破壞了軟組織中的膠原數(shù)量和質(zhì)量。更重要的是，研究中也發(fā)現(xiàn)周期性WBV刺激在術(shù)后的第5、12、19天均能夠顯著提升db/db組小鼠傷口組織的生物力學(xué)抗張強度。該結(jié)果表明，周期性WBV刺激能夠顯著改善db/db小鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中損傷周圍區(qū)域新生膠原的數(shù)量和質(zhì)量，而這一正向調(diào)控效應(yīng)很可能在周期性WBV刺激加速db/db小鼠組織損傷修復(fù)進程中發(fā)揮重要作用。

炎性反應(yīng)是軟組織創(chuàng)傷愈合過程中的重要階段，但是過度的炎性反應(yīng)會對創(chuàng)傷的修復(fù)進程產(chǎn)生負面影響，而大量的研究也表明2型糖尿病創(chuàng)傷愈合過程表現(xiàn)出被顯著延長的炎性反應(yīng)過程[20]。本研究中組織病理性染色結(jié)果揭示，db/db組小鼠在術(shù)后第12天仍能觀察到相比于Control組數(shù)量更高的炎性細胞數(shù)量，進一步證實2型糖尿病具有被延長的炎性反應(yīng)特性。ELISA檢測結(jié)果進一步表明，2型糖尿病的db/db組小鼠傷口組織周圍的促炎性因子IL-1β和TNF-α的表達量在術(shù)后的第5、12、19天均顯著高于Control組小鼠，證實了2型糖尿病損傷軟組織中的過炎性反應(yīng)狀態(tài)。而組織病理和ELISA結(jié)果均揭示，周期性WBV刺激能夠顯著減少db/db小鼠傷口組織的炎性細胞數(shù)量并降低炎性因子IL-1β和TNF-α的表達量。上述結(jié)果提示，周期性WBV刺激具有一定的抗炎性細胞生成和炎性因子表達的積極作用。

VEGF是一種組織創(chuàng)傷愈合的重要細胞因子，它參與血管生成并使毛細血管通透性增加，能夠反映創(chuàng)傷修復(fù)過程中的血管再生情況[21]。Ang1同樣是傷口愈合過程中血管新生的重要標志性因子，而以往研究也揭示Ang1與VEGF在傷口愈合過程中具有相同的變化趨勢[22]。本研究中ELISA結(jié)果顯示，db/db組小鼠軟組織中的VEGF和Ang1表達量在術(shù)后的第5、12、19天均顯著低于Control組，提示2型糖尿病的皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中血管新生過程被顯著破壞。同時周期性WBV刺激在術(shù)后的各時間點均能夠顯著提升db/db組小鼠軟組織周圍的VEGF和Ang1的表達量。以上結(jié)果提示，周期性WBV刺激能夠顯著加速2型糖尿病軟組織愈合過程中的血管新生，而這一效應(yīng)可能在周期性WBV刺激加速2型糖尿病軟組織創(chuàng)傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。

本研究中只使用了單一的WBV刺激參數(shù)（0.5g、45 Hz）對2型糖尿病小鼠進行刺激，因為該參數(shù)為一組經(jīng)典的、研究學(xué)者們廣泛使用的WBV刺激參數(shù)[23]。但是仍缺乏通過大規(guī)模動物實驗對于WBV刺激干預(yù)2型糖尿病傷口愈合最優(yōu)參數(shù)范圍的篩選，這也將是下一步研究的主要方向。

綜上所述，本研究從形態(tài)學(xué)、生物力學(xué)、組織病理學(xué)、分子生物學(xué)等方面系統(tǒng)證實了周期性WBV刺激能夠顯著加速2型糖尿病db/db小鼠的皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合修復(fù)進程，而這一積極效應(yīng)可能與其對膠原沉積的促進、血管新生的加強以及抗炎性因子的表達效應(yīng)具有密切關(guān)聯(lián)。本研究提示周期性WBV刺激作為一種無創(chuàng)、經(jīng)濟、安全的物理治療方法，有望成為臨床2型糖尿病軟組織創(chuàng)傷愈合修復(fù)治療的有效作用方式。