囊袋阻滯綜合征患者囊袋內(nèi)積聚液體及后發(fā)性白內(nèi)障囊膜的蛋白質(zhì)組成分析△

白宏英 王寧 王朝 劉平 蘇勝

囊袋阻滯綜合征(capsular block syndrome，CBS)是白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)一種少見的并發(fā)癥[1-2]，由于連續(xù)環(huán)形撕囊的撕囊口被人工晶狀體光學(xué)部阻塞，使人工晶狀體和后囊之間液體積聚，囊袋擴(kuò)張，進(jìn)而可能引起近視漂移、前房變淺、繼發(fā)性青光眼等合并癥。CBS根據(jù)發(fā)生時(shí)間不同分為術(shù)中、術(shù)后早期和術(shù)后晚期(術(shù)后2個(gè)月以后)[3]。術(shù)后晚期CBS發(fā)生的平均時(shí)間是3.8 a，囊袋內(nèi)積聚的液體通常為乳白色，Vélez 等[4]和Eifrig[5]研究顯示，其富含高濃度的α-晶狀體蛋白和相對(duì)低濃度的白蛋白。對(duì)于術(shù)后早期CBS，囊袋內(nèi)積聚液體的蛋白質(zhì)成分尚不清楚。本研究收集5例術(shù)后早期CBS患者，合并后發(fā)性白內(nèi)障和繼發(fā)性青光眼，通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定囊袋內(nèi)積液和后發(fā)性白內(nèi)障囊膜的蛋白質(zhì)組成，并與晶狀體皮質(zhì)和上皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)組成比較，探索它們的相似程度。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2016年7月至2018年6月來我院就診的術(shù)后早期(術(shù)后2個(gè)月內(nèi))CBS患者，人工晶狀體和后囊之間大量液體積聚，人工晶狀體前移引起近視漂移，其中5例前房變淺，合并后發(fā)性白內(nèi)障以及繼發(fā)性青光眼(眼壓 > 50 mmHg；1 kPa=7.5 mmHg)，如圖1示，且藥物不能充分散大瞳孔行前囊激光，囊袋內(nèi)積聚液體過多激光無法準(zhǔn)確聚焦后囊或者高度懷疑合并房水逆流和(或)房角明顯關(guān)閉、粘連，行手術(shù)治療。

圖1 CBS患者眼前節(jié)分析圖像。A：晶狀體和后囊之間大量積液，人工晶狀體前移，中周部虹膜與角膜相貼；B：對(duì)側(cè)眼眼前節(jié)分析；C：CBS眼裂隙燈顯微鏡圖像，前房淺，后囊膜混濁

1.2 主要試劑與儀器硫脲、尿素、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)均購自美國Sigma公司；測(cè)序級(jí)胰蛋白酶(美國Promega公司)。超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝)；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)(美國Thermo公司)；Pentacam眼前節(jié)分析系統(tǒng)(德國Oculus公司)；裂隙燈眼前節(jié)照相系統(tǒng)(日本Canon公司)

1.3 方法

1.3.1 樣品制備后發(fā)性白內(nèi)障囊膜液氮研磨后，混合低溫濃縮的囊袋積液，溶于1 mL強(qiáng)裂解液(7 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、30 mmol·L-1Tris、65 mmol·L-1CHAPS)提取蛋白質(zhì)[6]，冰上裂解40 min，4 ℃離心40 min(20 000 r·min-1)，吸取上清，即蛋白樣品。采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，對(duì)5份樣品進(jìn)行等量混合，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。5例同齡白內(nèi)障患者晶狀體皮質(zhì)以及前囊膜的上皮細(xì)胞收集后，也進(jìn)行上述蛋白質(zhì)樣品制備及后續(xù)質(zhì)譜分析。

1.3.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析蛋白樣品經(jīng)過還原、烷基化、酶切、凍干處理后，加入測(cè)序級(jí)胰蛋白酶，37 ℃水浴酶解15 h。所得肽段溶液凍干，-20 ℃保存?zhèn)溆?。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析是通過配有高效液相色譜的LTQ 質(zhì)譜儀實(shí)現(xiàn)的。具體流程和參數(shù)參考文獻(xiàn)[7-8]。將質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Mascot 法搜索人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(IPI_Human)，確定每份樣品的蛋白質(zhì)組成。在Mascot 搜索的數(shù)據(jù)，蛋白質(zhì)混合物中每個(gè)鑒定出來的蛋白對(duì)應(yīng)一個(gè)emPAI (exponentially modified protein abundance index) 數(shù)據(jù)，這個(gè)指數(shù)與該蛋白在混合物中的相對(duì)含量成正比[9]。根據(jù)emPAI 數(shù)據(jù)，估算蛋白樣品各組分的相對(duì)含量。根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索蛋白質(zhì)的功能。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)情況CBS患者基本信息見表1。術(shù)中吸出晶狀體和后囊之間積液，撕除并收集后囊中心約2.0 mm后發(fā)性白內(nèi)障囊膜，玻璃體切割刀修整切除瞳孔區(qū)殘余后發(fā)性白內(nèi)障囊膜和前段玻璃體，分離周邊虹膜的前粘連，打開房角，所有患者術(shù)后第1天前房明顯加深，中心部(瞳孔區(qū))后發(fā)性白內(nèi)障囊膜清除(圖2)，房角重新開放，術(shù)眼眼壓恢復(fù)至正常范圍內(nèi)，近視漂移(等效球鏡)顯著降低[術(shù)前為(-4.00±1.03)D，術(shù)后為(-0.22±0.91)D；P<0.01]，裸眼視力顯著提高[術(shù)前為(1.66±0.51)logMAR，術(shù)后為(0.40±0.22)logMAR；P<0.01)。

2.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)果對(duì)晶狀體和后囊之間積聚的液體及后發(fā)性白內(nèi)障囊膜進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，共鑒定出超過60種可信蛋白(檢測(cè)到特征性的肽段序列)，根據(jù)Mascot 搜索的數(shù)據(jù)估算各蛋白質(zhì)成分的相對(duì)含量，前10位主要成分見表2，含量最多的為αA-晶狀體蛋白。根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索的各蛋白成分的功能進(jìn)行分類：αA-晶狀體蛋白、βB1-晶狀體蛋白、αB-晶狀體蛋白屬于晶狀體蛋白，其中αA-晶狀體蛋白和αB-晶狀體蛋白還屬于分子伴侶；晶纖蛋白、肌動(dòng)蛋白、波形蛋白、錨蛋白2屬于細(xì)胞骨架；三磷酸甘油醛脫氫酶、促進(jìn)性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是葡萄糖代謝相關(guān)蛋白；熱休克蛋白A5屬于熱休克蛋白家族，也是分子伴侶。

同齡白內(nèi)障患者晶狀體皮質(zhì)以及前囊膜的上皮細(xì)胞液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)果顯示：晶狀體皮質(zhì)含量最多的有15種蛋白，主要包含各種晶狀體蛋白，其中βB1-晶狀體蛋白、αA-晶狀體蛋白、αB-晶狀體蛋白在囊袋內(nèi)積聚液體和后發(fā)性白內(nèi)障囊膜中的相對(duì)含量也較多；晶狀體上皮細(xì)胞中前15位相對(duì)含量較多的蛋白質(zhì)種類繁多，含量最多的αA-晶狀體蛋白、αB-晶狀體蛋白、波形蛋白、肌動(dòng)蛋白、三磷酸甘油醛脫氫酶在囊袋內(nèi)積聚液體和后發(fā)性白內(nèi)障囊膜中含量也較多。因此，CBS積聚液體和后發(fā)性白內(nèi)障囊膜蛋白成分和晶狀體前囊膜上皮細(xì)胞中蛋白質(zhì)組成更為相似。見表3。

表1 CBS患者基本信息

病例年齡性別人工晶狀體類型全身合并癥房角情況156男雙襻丙烯酸酯無全周關(guān)閉268女雙襻親水性丙烯酸高血壓全周關(guān)閉359女雙襻丙烯酸酯無全周關(guān)閉453女雙襻親水性丙烯酸無窄IV563男四襻親水性丙烯酸無全周關(guān)閉

圖2 CBS術(shù)后裂隙燈顯微鏡圖像。A：中心部后囊混濁切除；B：前房加深

表2 CBS囊袋內(nèi)積聚液體以及后發(fā)性白內(nèi)障囊膜的蛋白質(zhì)鑒定信息

基因名稱蛋白質(zhì)登記號(hào)相對(duì)分子質(zhì)量肽段序列?分?jǐn)?shù)/分#CRYAAαA-晶狀體蛋白IPI0002106220 011K.IQTGLDATHAER.A104BFSP1晶纖蛋白IPI0003028274 784R.LQLEAQFLQDDISAAK.D94ACTG1肌動(dòng)蛋白IPI0002144042 108K.DLYANTVLSGGTTMYPGIADR.M86GAPDH三磷酸甘油醛脫氫酶IPI0079525736 197K.LISWYDNEFGYSNR.V88VIM波形蛋白IPI0041847153 676R.LLQDSVDFSLADAINTEFK.N98CRYBB1βB1-晶狀體蛋白IPI0021609228 063R.RAEFSGECSNLADR.G102CRYABαB-晶狀體蛋白IPI0002136920 146R.IPADVDPLTITSSLSSDGVLTVNGPR.K96ANK2錨蛋白2IPI0038492863 721K.TEGDSSATALFPQTHK.E98HSPA5熱休克蛋白A5IPI0000336272 492K.KSDIDEIVLVGGSTR.I100SLC2A1促進(jìn)性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IPI0022019454 391R.TFDEIASGFR.Q81

注：*鑒定肽段的氨基酸序列。#鑒定出肽段的最高得分，超過40分提示具有特征性

表3 晶狀體皮質(zhì)和前囊膜上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)鑒定信息

晶狀體皮質(zhì)基因名稱蛋白質(zhì)前囊膜上皮細(xì)胞基因名稱蛋白質(zhì)CRYBB1βB1-晶狀體蛋白CRYAAαA-晶狀體蛋白CRYBA4βA4-晶狀體蛋白CRYABαB-晶狀體蛋白CRYAAαA-晶狀體蛋白VIM波形蛋白CRYBA1βA1-晶狀體蛋白CRYBB2βB2-晶狀體蛋白CRYBA3βA3-晶狀體蛋白ENO1α-烯醇化酶CRYABαB-晶狀體蛋白NCL核仁素CRYBB2βB2-晶狀體蛋白FLNA細(xì)絲蛋白ACRYGSγS-晶狀體蛋白HS90B熱休克蛋白90BCRYBB3βB3-晶狀體蛋白ACTG1肌動(dòng)蛋白CRYBA2βA2-晶狀體蛋白GAPDH三磷酸甘油醛脫氫酶CRYGCγC-晶狀體蛋白MYH9肌球蛋白9CRYGDγD-晶狀體蛋白PKM2丙酮酸激酶同工酶M1/M2ENO1α-烯醇化酶HSPA8熱休克蛋白A8SPTAN1α-收縮蛋白ANXA2膜聯(lián)蛋白A2HSPA8熱休克蛋白A8PLEC網(wǎng)蛋白

3 討論

術(shù)后晚期CBS囊袋內(nèi)積聚的液體通常為乳白色[10]，富含大量的α-晶狀體蛋白，由此研究者推測(cè)這些液體起源于晶狀體上皮細(xì)胞[5]。然而這樣的推論存在2個(gè)問題：(1)晶狀體皮質(zhì)同樣存在大量的α-晶狀體蛋白，這些晚期CBS患者不能排除白內(nèi)障術(shù)中少量皮質(zhì)殘留的影響；(2)由于晚期CBS患者(乳白色液體)α-晶狀體蛋白含量過高，會(huì)掩蓋其他蛋白質(zhì)，導(dǎo)致其他蛋白質(zhì)很難被鑒定出來，僅依靠α-晶狀體蛋白的推測(cè)則其依據(jù)不足。而術(shù)后CBS早期的液體成分對(duì)于推測(cè)它們的來源顯得更有依據(jù)。囊袋內(nèi)積聚的液體呈透明或者半透明，蛋白質(zhì)含量相對(duì)較少，鑒定結(jié)果很可能不易被某幾種高豐度蛋白質(zhì)掩蓋，而且由于液體相對(duì)透明，有利于顯微鏡下判斷皮質(zhì)是否明顯殘留。大部分術(shù)后早期CBS患者可行激光治療[11]，無法采集樣品，因此本研究選取合并繼發(fā)性青光眼，激光無法準(zhǔn)確聚焦后囊或者高度懷疑合并房水逆流和(或)房角明顯關(guān)閉、粘連的患者，手術(shù)治療過程中收集樣品進(jìn)行分析。另外，積聚液體成分及顏色的變化可能與后發(fā)性白內(nèi)障囊膜關(guān)系密切，本研究一起取材進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

本研究的患者都存在前囊撕囊口較小(< 5.1 mm)和后發(fā)性白內(nèi)障。白內(nèi)障手術(shù)后晶狀體上皮細(xì)胞和皮質(zhì)細(xì)胞會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化和增殖[12]，這可能引起后發(fā)性白內(nèi)障以及封閉前囊和晶狀體之間的間隙導(dǎo)致囊袋口阻塞。這些轉(zhuǎn)化、增殖后的細(xì)胞也能導(dǎo)致混濁液體的釋放，蓄積在晶狀體和后囊之間導(dǎo)致囊袋擴(kuò)張，繼而引起晶狀體前移、房角關(guān)閉[13]。另外，手術(shù)引起的血-房水屏障破壞導(dǎo)致不同分子、生長因子、激素以及各種細(xì)胞在囊袋內(nèi)沉積以及后發(fā)性白內(nèi)障[14]。隨著時(shí)間的延長，蓄積的液體在晚期CBS患者可變?yōu)槿榘咨?/p>

本研究中CBS患者囊袋內(nèi)積聚液體和后發(fā)性白內(nèi)障囊膜主要蛋白質(zhì)成分有5種(αA-晶狀體蛋白、αB-晶狀體蛋白、波形蛋白、肌動(dòng)蛋白、三磷酸甘油醛脫氫酶)，在晶狀體上皮細(xì)胞中含量也較多，與皮質(zhì)主要成分相同的只有3種。而且αA-晶狀體蛋白在CBS患者和晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)含量都最多。因此，CBS積聚液體和后發(fā)性白內(nèi)障囊膜主要蛋白成分與晶狀體上皮細(xì)胞相似程度更高。CBS患者中另外一種主要晶狀體蛋白(βB1-晶狀體蛋白)是皮質(zhì)(纖維)細(xì)胞的主要成分，而不在上皮細(xì)胞主要蛋白成分之列，提示這些積聚的液體以及后發(fā)性白內(nèi)障囊膜成分可能有少部分來自皮質(zhì)(纖維)細(xì)胞。除了晶狀體蛋白，CBS蓄積液體和后發(fā)性白內(nèi)障主要蛋白質(zhì)成分還包含4種細(xì)胞骨架蛋白：晶纖蛋白、肌動(dòng)蛋白、波形蛋白、錨蛋白2。電鏡觀察上皮細(xì)胞可發(fā)生變性，包括上皮細(xì)胞漿內(nèi)大量空泡形成、線粒體腫脹、細(xì)胞核呈氣球樣突起、胞漿內(nèi)容物丟失，最終只剩腫脹的細(xì)胞骨架[15]；而晶狀體纖維變性表現(xiàn)為晶狀體纖維物質(zhì)的乳化、高密度顆粒狀物進(jìn)入細(xì)胞間隙，最終纖維斷裂、皮質(zhì)崩解。因此，這些細(xì)胞骨架蛋白可能部分來自轉(zhuǎn)化、增殖、變性的晶狀體上皮、纖維細(xì)胞，隨著這些變性細(xì)胞的不斷死亡、釋放蛋白質(zhì)，CBS囊袋內(nèi)積液蛋白質(zhì)濃度也不斷增高，以致晚期呈乳白色。

CBS積液及后發(fā)性白內(nèi)障囊膜成分中包含兩種糖代謝相關(guān)蛋白：三磷酸甘油醛脫氫酶和促進(jìn)性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這兩種蛋白含量較高，提示在CBS發(fā)生過程中葡萄糖代謝可能比較旺盛；而另外一種熱休克蛋白A5，以及αA-晶狀體蛋白、αB-晶狀體蛋白都屬于分子伴侶，它們的高含量說明，在此過程中可能涉及大量錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)需要修復(fù)[16]。

另外，本研究所選取的患者(繼發(fā)青光眼)不一定能代表其他早期CBS(未合并青光眼和后發(fā)性白內(nèi)障)患者的蛋白質(zhì)組成。通常CBS患者的白內(nèi)障手術(shù)過程無從考究，比如是否殘留少量皮質(zhì)等，這會(huì)造成CBS積液成分出現(xiàn)較大的個(gè)體差異，本研究選取患者的過程中也只能由經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師盡可能地排除皮質(zhì)殘留的患者。再者，在合并后發(fā)性白內(nèi)障尤其青光眼的病理情況下，晶狀體皮質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞這些代謝相對(duì)活躍的細(xì)胞所分泌蛋白質(zhì)的種類和量可能都發(fā)生了變化，本研究的結(jié)果也只能代表這種情境下的蛋白質(zhì)組成，含量比較多的結(jié)構(gòu)性蛋白(如晶狀體蛋白以及細(xì)胞骨架蛋白)對(duì)于沒有其他合并癥的CBS患者可能有一定參考意義，需要后續(xù)研究證實(shí)。

致謝：感謝北京蛋白質(zhì)組研究中心陳碩在質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析方面的幫助!