后部鞏膜F4/80和CD206陽(yáng)性巨噬細(xì)胞在小鼠形覺(jué)剝奪性近視發(fā)生發(fā)展中的變化△

李東輝 龍琴 王靜怡 陳晨

近視是指在調(diào)節(jié)放松狀態(tài)下，平行光線經(jīng)眼球屈光系統(tǒng)聚焦在視網(wǎng)膜之前的一種視覺(jué)形式，是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的屈光不正，并且呈逐年上升的趨勢(shì)，已成為導(dǎo)致視力受損和盲的全球性公共衛(wèi)生健康問(wèn)題，然而，到目前為止，其確切的發(fā)病機(jī)制仍需探索和完善[1-2]。鞏膜，尤其是后部鞏膜，作為近視相關(guān)機(jī)制作用下的最終靶組織，始終是近視領(lǐng)域的研究重點(diǎn)[3-4]。前期研究和近期報(bào)道提示，近視的發(fā)生與全身或眼部炎癥具有顯著相關(guān)性[5-7]，然而，炎癥對(duì)于近視發(fā)生發(fā)展是因還是果？炎癥通過(guò)何種通路促進(jìn)近視發(fā)生和發(fā)展呢？目前尚需進(jìn)一步研究及探討。巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫炎癥相關(guān)細(xì)胞，是研究創(chuàng)傷修復(fù)、炎癥調(diào)控和分子免疫的重要對(duì)象[8-9]，然而，目前對(duì)于巨噬細(xì)胞和近視的相關(guān)性研究不足。本研究擬通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)近視誘導(dǎo)小鼠后部鞏膜通用型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD206的表達(dá)，分析F4/80+巨噬細(xì)胞和F4/80+/CD206+巨噬細(xì)胞的表達(dá)以及與小鼠近視發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4周齡C57BL/6雄性健康小鼠24只48眼(北京協(xié)和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，在自然照明環(huán)境下飼養(yǎng)，自由攝入食水，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和處理經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.1.2 主要試劑與儀器本研究所采用的抗體均購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司，具體包括：大鼠抗小鼠F4/80熒光標(biāo)記抗體(FITC，Cat 123108)及同型對(duì)照(FITC標(biāo)記大鼠IgG2a isotype Ctrl 抗體)；大鼠抗小鼠CD206熒光標(biāo)記抗體(PE，Cat 141706)及同型對(duì)照(PE標(biāo)記大鼠IgG2a isotype Ctrl 抗體)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD LSR II)；200目尼龍網(wǎng)(上海晶安生物科技有限公司，約70 μm孔徑)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠形覺(jué)剝奪性近視模型的建立C57BL/6小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分別接受形覺(jué)剝奪處理和無(wú)處理(各12只)，研究分為3組：形覺(jué)剝奪組(單眼遮蓋，n=12)，自身對(duì)照組(對(duì)側(cè)眼無(wú)遮蓋，n=12)，正常對(duì)照組(n=12)。形覺(jué)剝奪組取右眼為形覺(jué)剝奪眼，采用圓形不透光塑料眼罩，直徑10 mm，粘貼于小鼠眼球周圍(避免膠水流入眼內(nèi))，頸部套塑料項(xiàng)圈防止小鼠將眼罩剝離。每天巡視小鼠一次，若眼罩或塑料項(xiàng)圈剝離，及時(shí)更換。對(duì)側(cè)眼為自身對(duì)照眼。正常對(duì)照組小鼠不作任何處理(取右眼參與統(tǒng)計(jì)分析)。

1.2.2 小鼠屈光度和眼軸檢測(cè)小鼠實(shí)驗(yàn)前(實(shí)驗(yàn)0 d)、實(shí)驗(yàn)14 d和實(shí)驗(yàn)28 d時(shí)用5 g·L-1托吡卡胺滴眼液滴眼，每10 min滴眼一次，每次20 μL，共4次。在睫狀肌麻痹狀態(tài)下由有經(jīng)驗(yàn)的驗(yàn)光師進(jìn)行帶狀光檢影驗(yàn)光，獲得等效球鏡屈光度數(shù)(球鏡屈光度加1/2散光度)。實(shí)驗(yàn)14 d和28 d，屈光度檢測(cè)后采用頸椎脫臼法分別處死6只小鼠分離眼球，清除球周組織，用千分尺測(cè)量眼軸長(zhǎng)度3次，取平均值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞頸椎脫臼法處死小鼠，迅速分離眼球，清除鞏膜外組織，沿鋸齒緣將鞏膜分為前、后兩部，保留后部鞏膜組織置于培養(yǎng)皿中，加入消化液，覆蓋組織，放入37 ℃恒溫箱作用30 min；用一次性注射器針頭將組織劃碎，用200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞2次；1000 r·min-1離心5 min棄上清，再用PBS洗滌細(xì)胞一次，重懸后計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度；取106個(gè)細(xì)胞約100 μL細(xì)胞懸液到流式樣品管中，加入最佳濃度F4/80 FITC和CD206 PE熒光標(biāo)記抗體，混勻后室溫避光反應(yīng)20 min；加入PBS清洗2次，混勻后1000 r·min-1離心5 min棄上清；加入500 μL PBS重懸后采用流式細(xì)胞儀分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Kolmogorov-Smirnov Test進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)性分布檢驗(yàn)，采用單因素干預(yù)隨機(jī)分組設(shè)計(jì)，3組各指標(biāo)的總體差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)14 d和實(shí)驗(yàn)28 d指標(biāo)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 形覺(jué)剝奪性近視小鼠模型的誘導(dǎo)情況實(shí)驗(yàn)0 d，形覺(jué)剝奪組、自身對(duì)照組和正常對(duì)照組的屈光度分別為(4.94±0.68)D、(5.10±0.51)D和(5.02±0.74)D，3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)14 d，3組屈光度和眼軸差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。實(shí)驗(yàn)28 d，3組屈光度和眼軸差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；實(shí)驗(yàn)28 d，形覺(jué)剝奪組比自身對(duì)照組明顯向近視偏移(-3.50±1.18)D，屈光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，并伴有眼軸的顯著延長(zhǎng)(P=0.02)；形覺(jué)剝奪組比正常對(duì)照組向近視偏移(-3.45±1.11)D，屈光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；并伴有眼軸的顯著延長(zhǎng)(P=0.03)；自身對(duì)照組和正常對(duì)照組的屈光度和眼軸差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。形覺(jué)剝奪28 d比形覺(jué)剝奪14 d產(chǎn)生顯著的近視偏移(-5.67±0.79)D(t=11.36，P<0.001)，伴眼軸增長(zhǎng)(0.16±0.08)mm(t=4.39，P=0.001)，見(jiàn)表1。

組別n屈光度/D實(shí)驗(yàn)14 d實(shí)驗(yàn)28 d眼軸長(zhǎng)度/mm實(shí)驗(yàn)14 d實(shí)驗(yàn)28 d形覺(jué)剝奪組63.92±1.03-1.75±0.65?#△3.15±0.073.31±0.05?#△自身對(duì)照組64.13±0.611.75±0.823.12±0.173.21±0.05正常對(duì)照組64.08±1.041.67±0.563.16±0.113.23±0.07F值0.0950.680.154.45P值0.920.0010.860.03

注：與各自的自身對(duì)照組比較，*P<0.05 (單因素方差分析，LSD檢驗(yàn))；與各自正常對(duì)照組比較，#P<0.05(單因素方差分析，LSD檢驗(yàn))；與形覺(jué)剝奪組實(shí)驗(yàn)14 d比較，△P<0.05 (獨(dú)立樣本t檢驗(yàn))

2.2 各組小鼠后部鞏膜組織中F4/80和CD206的表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)14 d、28 d，形覺(jué)剝奪組、自身對(duì)照組和正常對(duì)照組相比，形覺(jué)剝奪組后部鞏膜F4/80陽(yáng)性(F4/80+)巨噬細(xì)胞百分比均顯著高于自身對(duì)照組和正常對(duì)照組(均為P<0.05)。實(shí)驗(yàn)14 d，形覺(jué)剝奪組后部鞏膜F4/80和CD206陽(yáng)性(F4/80+/CD206+)巨噬細(xì)胞百分比均顯著高于自身對(duì)照組和正常對(duì)照組(均為P<0.05)。實(shí)驗(yàn)28 d，形覺(jué)剝奪組后部鞏膜F4/80+/CD206+巨噬細(xì)胞百分比均顯著高于自身對(duì)照組和正常對(duì)照組(均為P<0.05)。自身對(duì)照組和正常對(duì)照組F4/80+和F4/80+/CD206+巨噬細(xì)胞百分比在實(shí)驗(yàn)14 d、28 d時(shí)相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。實(shí)驗(yàn)28 d，形覺(jué)剝奪組小鼠后部鞏膜F4/80+/CD206+巨噬細(xì)胞百分比較實(shí)驗(yàn)14 d時(shí)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.68，P=0.02)。實(shí)驗(yàn)28 d，形覺(jué)剝奪組小鼠后部鞏膜F4/80+巨噬細(xì)胞百分比和實(shí)驗(yàn)14 d時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.86，P=0.09)，見(jiàn)表2。

組別nF4/80+巨噬細(xì)胞/%實(shí)驗(yàn)14 d實(shí)驗(yàn)28 dF4/80+/CD206+巨噬細(xì)胞/%實(shí)驗(yàn)14 d實(shí)驗(yàn)28 d形覺(jué)剝奪組60.91±0.311.19±0.210.45±0.330.87±0.19#自身對(duì)照組60.48±0.10?0.85±0.23?0.12±0.06?0.50±0.27?正常對(duì)照組60.45±0.21?0.79±0.23?0.21±0.160.51±0.28?F值8.245.793.904.23P值0.0040.010.040.03

注：與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的形覺(jué)剝奪組比較，*P<0.05 (單因素方差分析，LSD檢驗(yàn))；與形覺(jué)剝奪組實(shí)驗(yàn)14 d比較，#P<0.05 (獨(dú)立樣本t檢驗(yàn))

2.3 形覺(jué)剝奪組小鼠后部鞏膜組織中F4/80+、F4/80+/CD206+巨噬細(xì)胞百分比和屈光度、眼軸的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)28 d，形覺(jué)剝奪組后部鞏膜F4/80+/CD206+巨噬細(xì)胞百分比和屈光度呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.89，P=0.02；圖1)，和眼軸呈顯著正相關(guān)(r=0.98，P=0.001；圖2)。實(shí)驗(yàn)28 d，形覺(jué)剝奪組后部鞏膜F4/80+巨噬細(xì)胞百分比和屈光度及眼軸均無(wú)顯著相關(guān)性(均為P>0.05)。

圖1 實(shí)驗(yàn)28 d，形覺(jué)剝奪組后部鞏膜F4/80+/CD206+巨噬細(xì)胞百分比和屈光度的相關(guān)性

圖2 實(shí)驗(yàn)28 d，形覺(jué)剝奪組后部鞏膜F4/80+/CD206+巨噬細(xì)胞百分比和眼軸的相關(guān)性

3 討論

本研究探討了近視發(fā)生發(fā)展過(guò)程中是否存在后部鞏膜巨噬細(xì)胞的參與，結(jié)果表明，C57BL/6小鼠形覺(jué)剝奪性近視的形成伴隨后部鞏膜F4/80+/CD206+巨噬細(xì)胞的增加和動(dòng)態(tài)變化，F(xiàn)4/80+/CD206+巨噬細(xì)胞的數(shù)量和屈光度存在顯著負(fù)相關(guān)，同時(shí)和眼軸呈顯著正相關(guān)，提示F4/80+/CD206+巨噬細(xì)胞參與C57BL/6小鼠形覺(jué)剝奪性近視的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。

大量研究顯示，后部鞏膜起到對(duì)眼球形狀和大小的塑形作用，在此過(guò)程中，以基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)過(guò)度活化為代表的基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)功能失衡起到重要的促進(jìn)作用，上調(diào)MMP-2導(dǎo)致膠原纖維降解是近視發(fā)生發(fā)展過(guò)程中后部鞏膜重塑和眼軸延長(zhǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10-11]。有研究表明，巨噬細(xì)胞具有調(diào)控MMP-2的功能，從而影響疾病的進(jìn)程[12-13]。因此，后部鞏膜巨噬細(xì)胞的功能將對(duì)近視形成具有潛在影響，對(duì)此目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究尚少。

最常見(jiàn)的分類將巨噬細(xì)胞分為經(jīng)典活化型(M1)和替代活化型(M2)，不同種類的巨噬細(xì)胞在體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境中發(fā)揮不同的功能[14]，其中M1型巨噬細(xì)胞具備很強(qiáng)的抗原提呈能力，發(fā)揮促進(jìn)炎癥和自身免疫的作用；而M2型巨噬細(xì)胞則起到抑制炎癥的作用[15-16]，此外，研究表明，M2型巨噬細(xì)胞通過(guò)上調(diào)MMP-2的表達(dá)，從而促進(jìn)膠原降解[17]。目前的研究認(rèn)為，F(xiàn)4/80是巨噬細(xì)胞的經(jīng)典通用標(biāo)志物，既識(shí)別M1型又識(shí)別M2型巨噬細(xì)胞，被廣泛用于標(biāo)記總巨噬細(xì)胞[18]。由于M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)CD206，即甘露糖受體[19]，因此，CD206被認(rèn)為是高度可信的M2型巨噬細(xì)胞的常用標(biāo)志物，F(xiàn)4/80+/CD206+則可代表M2型巨噬細(xì)胞[20]。

本研究結(jié)果顯示，形覺(jué)剝奪28 d導(dǎo)致小鼠近視形成，同時(shí)伴隨形覺(jué)剝奪組后部鞏膜F4/80+/CD206+巨噬細(xì)胞的表達(dá)升高，這一趨勢(shì)在小鼠形覺(jué)剝奪性近視形成之前(實(shí)驗(yàn)14 d)已經(jīng)存在。因此，小鼠后部鞏膜M2型巨噬細(xì)胞的增加和動(dòng)態(tài)變化早于近視形成。此外，實(shí)驗(yàn)28 d形覺(jué)剝奪組后部鞏膜F4/80+/CD206+巨噬細(xì)胞百分比和屈光度呈顯著負(fù)相關(guān)性，和眼軸呈顯著正相關(guān)性，進(jìn)一步提示M2型巨噬細(xì)胞增加對(duì)近視發(fā)生的促進(jìn)作用。

如前所述，F(xiàn)4/80+代表總巨噬細(xì)胞，本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)14 d和28 d形覺(jué)剝奪組后部鞏膜F4/80+巨噬細(xì)胞百分比均高于自身對(duì)照組和正常對(duì)照組，然而，未發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)28 d形覺(jué)剝奪組后部鞏膜F4/80+巨噬細(xì)胞百分比和屈光度及眼軸的相關(guān)性，因此提示，在巨噬細(xì)胞參與的小鼠形覺(jué)剝奪性近視的發(fā)生發(fā)展中，M2型巨噬細(xì)胞極化類型，而非總巨噬細(xì)胞，可能是促進(jìn)近視形成的關(guān)鍵因素。

雖然本研究初步證實(shí)了巨噬細(xì)胞，主要是M2型巨噬細(xì)胞參與C57BL/6小鼠形覺(jué)剝奪性近視形成的假設(shè)，然而，本研究存在以下不足：首先，由于小鼠后部鞏膜巨噬細(xì)胞數(shù)量較少，雖然經(jīng)過(guò)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)和方法改良，細(xì)胞活性的保持仍有待進(jìn)一步完善，同時(shí)本研究例數(shù)不足，給數(shù)據(jù)分析造成一定偏差，可能是本研究未發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)14 d形覺(jué)剝奪組和正常對(duì)照組F4/80+/CD206+巨噬細(xì)胞百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的原因之一；其次，本研究單純探討了巨噬細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，尚未包含MMP-2等近視相關(guān)蛋白及生長(zhǎng)因子，如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β等的檢測(cè)以及和巨噬細(xì)胞變化的相關(guān)性研究。因此，M2型巨噬細(xì)胞和近視發(fā)生發(fā)展的因果關(guān)系及作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究加以證實(shí)，從而為近視的防控提供新的思路和治療靶點(diǎn)。