熱休克蛋白5調控內質網應激在視網膜色素上皮細胞保護中的作用△

馮競仰 陸冰 朱鴻 孫向軍 孫曉東

視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)位于脈絡膜與視網膜神經上皮層之間，參與組成血-視網膜屏障，吞噬轉運視循環(huán)產物，對維持光感受器細胞代謝和視網膜功能起著至關重要的作用。生理狀態(tài)下，RPE細胞不斷吞噬光感受器細胞外節(jié)脫落的膜盤以維持其日常代謝。隨著年齡增長，部分不能被溶酶體消化的膜盤沉積在RPE細胞內，形成脂褐素[1]。大量脂褐素堆積并釋放光化學毒性物質導致RPE細胞損傷和功能減退，是年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)發(fā)病的重要機制之一[2-3]。N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(N-retinylidene-N-retinylethanolamine，A2E)作為RPE細胞內脂褐素的主要熒光基團，可在430～480 nm波段內的光照刺激下產生大量活性氧，導致RPE細胞損傷[4]。近年來，隨著對細胞損傷機制研究的不斷深入，人們發(fā)現除了經典的線粒體相關凋亡途徑外，內質網同樣可以感知和整合損傷信號，參與細胞凋亡[5]。本研究通過建立A2E聯合藍光誘導RPE細胞損傷模型，探討內質網應激參與RPE細胞損傷的過程，以及相對分子質量70 000的熱休克蛋白5(heat shock 70 kDa protein 5，HSPA5)對RPE細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器人ARPE-19細胞株(American Type Culture Collection，美國)，全反式視黃醛、乙醇胺(Sigma，美國)，DMEM/F12(Dulbecco’s modified Eagle’s/Ham’s F12)11培養(yǎng)液、胎牛血清(Gibco，美國)，CCK-8細胞活性檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天，中國)，慢病毒質粒LV-HSPA5-GFP-shRNA、LV-NC-GFP-shRNA(上海吉瑪制藥技術有限公司)，HSPA5單克隆抗體(Cat.3216-1，Epitomics，美國)，CHOP單克隆抗體(Cat.sc-7351)、caspase-12多克隆抗體(Cat.sc-70227)、β-actin單克隆抗體(Cat.sc-8432；Santa Cruz，美國)。L18W/71型藍光燈(Osram，德國)，5202型數字光照度計(Kyoritsu，日本)，IX70型倒置相差顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)，680型酶聯免疫檢測儀(Bio-Rad，美國)等。

1.2 方法

1.2.1 RPE細胞培養(yǎng)人RPE細胞復蘇后加入DMEM/F12培養(yǎng)液(含體積分數10%胎牛血清)，置于37 ℃、含體積分數5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據細胞生長速度，按12比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)。使用胰蛋白酶溶液收集對數生長期RPE細胞，計數后稀釋至100× 106個·L-1。將細胞懸液依據實驗要求接種于培養(yǎng)皿，待RPE細胞貼壁生長至80%～90%融合后，換成無血清培養(yǎng)液，放置24 h后再接受處理。

1.2.2 A2E聯合藍光誘導RPE細胞損傷模型建立A2E由全反式視黃醛和乙醇胺依據參考文獻化學合成[4，6]。(1)A2E與RPE細胞共培養(yǎng)：將含25 μmol·L-1A2E的培養(yǎng)液加入RPE細胞中，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h；去除原培養(yǎng)液，溫PBS清洗細胞，充分洗去細胞外A2E，重新加入不含胎牛血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；運用光學倒置顯微鏡觀察RPE細胞內A2E顆粒情況；激光共聚焦顯微鏡觀察RPE細胞內A2E自發(fā)熒光情況。(2)聯合藍光誘導RPE細胞損傷：采用L18W/71型藍光燈在(460±20)nm照射A2E共培養(yǎng)后的RPE細胞20 min，光照在暗室中密閉進行，無自然光干擾，電子溫度計監(jiān)測室溫為(37.0±0.3)℃，光照度計檢測細胞水平上光照強度為4000 lux。對照組為不作任何處理的RPE細胞。

1.2.3 HSPA5 shRNA慢病毒載體構建和轉染干擾質粒LV-HSPA5-GFP-shRNA(干擾序列5’-GCTCGACTCGAATTCCAAAGA-3’)和陰性對照LV-NC-GFP-shRNA(干擾序列5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)的構建由上海吉瑪制藥技術有限公司完成。將RPE細胞按每孔1.5 × 106個接種至24孔培養(yǎng)板內，培養(yǎng)24 h，每孔加入0.5 mL凝膠胺，使其濃度為6 mg·L-1，室溫孵育30 min以提高細胞感染效率，再加入含shRNA慢病毒顆粒的培養(yǎng)液，每孔200 μL，培養(yǎng)過夜后更換為新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用750 μg·L-1嘌呤霉素進行藥物篩選，將篩選出的耐藥細胞株擴大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定沉默HSPA5基因的RPE細胞。細胞隨機分為3組：轉染HSPA5干擾序列的RPE細胞為HSPA5干擾組；轉染陰性對照序列的RPE細胞為陰性干擾組；未轉染的RPE細胞為野生型組。轉染72 h后做后續(xù)實驗。采用熒光顯微鏡觀察RPE細胞內GFP熒光表達，Western blot檢測HSPA5蛋白表達，驗證HSPA5基因干擾有效性。

1.2.4 RPE細胞活力檢測采用CCK-8法檢測細胞活力。收集對數生長期RPE細胞，計數后稀釋至100×106個·L-1，以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板內。按各實驗目的處理細胞：(1)按1.2.2方法誘導A2E聯合藍光損傷RPE細胞后，分別培養(yǎng)3 h、6 h、12 h、24 h和48 h，檢測細胞活力的變化；(2)按 1.2.3 方法處理細胞后，對HSPA5干擾組、陰性干擾組、野生型組RPE細胞均給予A2E聯合藍光誘導細胞損傷后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，檢測細胞活力的變化；(3)檢測對照組細胞活力。具體檢測方法為：去除培養(yǎng)液，溫PBS沖洗細胞，每孔加入含20 μL CCK-8試劑的培養(yǎng)液100 μL，置于培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育2 h。采用酶聯免疫檢測儀在450 nm波長處測定吸光度值。最終細胞活力結果表示為A2E處理組吸光度值與對照組吸光度值的比值。每組設定5個復孔，實驗重復3次。

1.2.5 Western blot檢測RPE細胞培養(yǎng)于9 cm培養(yǎng)皿中，按各實驗目的處理細胞：(1)按1.2.2方法誘導A2E聯合藍光損傷RPE細胞后，分別培養(yǎng)3 h、6 h、12 h、24 h和48 h，檢測HSPA5和CHOP蛋白的表達變化；(2)按1.2.3方法處理細胞后，檢測HSPA5干擾組、陰性干擾組、野生型組HSPA5蛋白表達情況，之后對3組細胞均給予A2E聯合藍光誘導細胞損傷后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，檢測HSPA5、CHOP和Caspase-12蛋白的表達變化；(3)檢測對照組HSPA5、CHOP和Caspase-12蛋白的表達。具體檢測方法為：去除培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入細胞裂解液。收集細胞，于4 ℃ 下12 000 r·min-1離心5 min，取含蛋白的上清液。每100 μL蛋白樣品加入25 μL 蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴8 min。運用SDS-PAGE對樣品中的蛋白進行分離，并轉移至PVDF膜。使用含50 g·L-1脫脂牛奶和體積分數0.1%Tween-20的TBS封閉 2 h，分別加入11000稀釋的HSPA5抗體、1200稀釋的CHOP抗體、1200稀釋的Caspase-12抗體，于4 ℃孵育過夜。TBST沖洗后加入二抗，于37 ℃孵育2 h。使用ECL顯色，Bio-Rad凝膠成像儀采集圖像。運用Image-J分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析使用SPSS 17.0軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差表示，采用單因素方差分析比較組間差異性，檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 A2E聯合藍光誘導RPE細胞損傷倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現，A2E共培養(yǎng)的RPE細胞內出現棕黃色顆粒，而對照組RPE細胞中未見明顯顆粒狀物質。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現，A2E共培養(yǎng)的RPE細胞中A2E呈現綠色自發(fā)熒光，而對照組未觀察到該熒光。CCK-8法檢測結果顯示，A2E聯合藍光處理后3 h、6 h、12 h、24 h和48 h，RPE細胞活力分別是對照組的(80.9±6.2)%、(73.3±5.8)%、(70.6±5.4)%、(62.3±6.1)%和(51.4±4.5)%，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。見圖1。

2.2 RPE細胞損傷時內質網應激相關蛋白HSPA5和CHOP表達Western blot檢測結果顯示，內質網應激標志分子HSPA5蛋白表達在RPE細胞損傷后6 h顯著升高，12 h時達到高峰，之后逐漸下降。而CHOP作為內質網應激介導的凋亡相關分子，在對照組表達量低，經A2E及藍光處理后3 h CHOP蛋白表達出現升高，12 h時有小幅回落，24-48 h時又逐步上升(圖2)。提示內質網應激參與A2E聯合藍光誘導RPE細胞損傷。

圖1 A2E與RPE細胞共培養(yǎng)。A：倒置相差顯微鏡下，A2E共培養(yǎng)的RPE細胞內出現棕黃色顆粒；B：倒置相差顯微鏡下，對照組中未見明顯顆粒狀物質；C：激光共聚焦顯微鏡下，A2E共培養(yǎng)的RPE細胞中A2E呈綠色自發(fā)熒光；D：激光共聚焦顯微鏡下，對照組中未觀察到該熒光

圖2 Western blot檢測A2E聯合藍光誘導RPE細胞損傷后HSPA5和CHOP蛋白表達。與對照組相比，*P<0.05

2.3 HSPA5基因干擾RPE細胞穩(wěn)株獲得為了驗證HSPA5基因干擾的RPE細胞是否穩(wěn)定且有效，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現，慢病毒處理RPE細胞后72 h，HSPA5干擾組細胞內存在GFP熒光表達，提示RPE細胞已被LV-HSPA5-GFP-shRNA有效轉染。采用Western blot檢測轉染RPE細胞中HSPA5蛋白表達，結果顯示，慢病毒處理72 h后，HSPA5干擾組中HSPA5蛋白表達較野生型組顯著下降(P<0.05)，而陰性干擾組HSPA5蛋白表達與野生型組相比未受明顯抑制(P>0.05)。見圖3。

2.4 沉默HSPA5加重A2E聯合藍光誘導RPE細胞損傷Western blot檢測結果顯示，A2E聯合藍光損傷RPE細胞后12 h，HSPA5干擾組中HSPA5蛋白表達較野生型組和陰性干擾組均明顯下降(均為P<0.05)。HSPA5干擾組與野生型組、陰性干擾組相比CHOP和Caspase-12蛋白表達均顯著提高(均為P<0.05)。細胞活力檢測結果顯示，A2E聯合藍光處理RPE細胞后12 h，HSPA5干擾組RPE細胞活力降低至(56.3±5.1)%，較野生型組(72.9±7.1)%和陰性干擾組(70.3±6.6)%均顯著降低(均為P<0.05)。提示HSPA5基因干擾可上調內質網應激相關凋亡蛋白CHOP、Caspase-12的表達，并加重A2E及藍光對RPE細胞的損傷。見圖4。

圖3 HSPA5基因干擾RPE細胞穩(wěn)株獲得。A：光鏡下LV-HSPA5-GFP-shRNA轉染RPE細胞后72 h，HSPA5干擾組細胞(標尺：50 μm);B:熒光顯微鏡下LV-HSPA5-GFP-shRNA轉染RPE細胞后72 h，HSPA5干擾組細胞內存在GFP熒光表達(標尺：50 μm)；C：Western blot檢測電泳結果；D：Western blot檢測數據分析結果，慢病毒處理72 h后，HSPA5干擾組中HSPA5蛋白表達較野生型組顯著下降(*P<0.05)，而陰性干擾組HSPA5蛋白表達未受明顯抑制

圖4 沉默HSPA5加重A2E聯合藍光誘導RPE細胞損傷。A：Western blot檢測電泳結果；B：Western blot檢測數據分析結果，A2E聯合藍光損傷RPE細胞后12 h，HSPA5干擾組中的HSPA5蛋白表達較野生型組和陰性干擾組均明顯下降(*P<0.05)，CHOP和Caspase-12蛋白在HSPA5干擾組中的表達與野生型組和陰性干擾組相比均顯著提高(*P<0.05)；C：細胞活力檢測結果顯示，A2E聯合藍光損傷RPE細胞后12 h，HSPA5干擾組RPE細胞活力較野生型組和陰性干擾組均顯著降低(*P<0.05)

3 討論

RPE細胞對維持光感受器細胞代謝和視網膜功能起著至關重要的作用。隨著年齡增長，脂褐素積聚于RPE細胞內，持續(xù)暴露于可見光、紫外線等，誘發(fā)光化學毒性物質釋放，導致RPE細胞損傷是AMD病理改變的始動環(huán)節(jié)。正常RPE細胞可通過自噬及溶酶體相關途徑逐步降解被吞噬的膜盤，以保持RPE細胞內環(huán)境穩(wěn)定。然而，隨著RPE細胞的衰老，其處理代謝產物的能力下降，大量有害物質無法被清除，形成脂褐素積聚。有研究證實，老年人視網膜黃斑部RPE細胞內脂褐素可占到整個細胞面積的約20%[7]。Eldred[8]從老年人視網膜組織中提取出大量脂褐素顆粒，并從中分離出其主要熒光基團A2E。A2E具有很強的光化學毒性，尤其對藍光敏感。本研究觀察到RPE細胞吞噬了A2E后，在藍光照射下細胞活力出現顯著下降，且隨著時間延長細胞損傷加重。有研究表明，在藍光激發(fā)下，A2E會發(fā)生光氧化反應產生多種活性氧，包括單態(tài)氧、過氧化物等[9]。一方面這些活性氧可以攻擊細胞的線粒體、內質網、DNA雙鏈等，直接導致RPE細胞損傷[10]，另一方面又可以誘導A2E之間通過C-C雙鍵結合，形成A2E的環(huán)氧化合物。這些環(huán)氧化合物既能進一步加速活性氧生成，又能導致RPE細胞損傷[11]。

新近研究發(fā)現，內質網可以感知和整合損傷信號，參與細胞凋亡，在AMD發(fā)病機制中起重要作用[12]。作為真核細胞中新合成蛋白質折疊與組裝的加工廠，內質網對外界應激因素十分敏感。在各種應激原刺激下，大量錯誤折疊或未折疊蛋白會在內質網內聚集，引起內質網穩(wěn)態(tài)失衡誘發(fā)內質網應激[13]。本研究結果顯示，A2E聯合藍光誘導RPE細胞損傷時內質網應激相關分子HSPA5和CHOP蛋白表達較正常對照組顯著升高。HSPA5又稱免疫球蛋白重鏈結合蛋白，是熱休克蛋白70家族成員之一，長期位于內質網內，是內質網應激感受器和關鍵分子伴侶[14]。生理狀態(tài)下，HSPA5通常與內質網膜上的三種跨膜蛋白，即類RNA依賴蛋白激酶樣內質網激酶(PERK)、轉錄激活因子6(ATF6)、肌醇依賴內質網至細胞核信號激酶1(IRE1)結合，處于休眠狀態(tài)。內質網應激發(fā)生初期，HSPA5與跨膜蛋白解離，啟動未折疊蛋白反應，同時自身表達上調，輔助蛋白質正確折疊，清除異常蛋白，以恢復內質網穩(wěn)態(tài)，維持細胞生存[15]。本研究中HSPA5蛋白在RPE細胞損傷早期升高，提示在A2E及藍光照射刺激下，RPE細胞出現一系列內穩(wěn)態(tài)失衡，激活了內質網應激反應，早期通過上調HSPA5蛋白表達，協助異常蛋白折疊并啟動降解途徑，從而促進內質網恢復穩(wěn)態(tài)。而RPE細胞損傷后48 h，HSPA5蛋白水平呈下降趨勢，推測持續(xù)劇烈的應激導致RPE細胞不可逆損傷，從而激活內質網應激介導的凋亡途徑。

CHOP作為內質網應激介導的凋亡途徑中重要調控分子之一，在正常生理條件下表達量較低，當受到應激刺激時，CHOP表達水平升高，提示細胞啟動內質網應激相關凋亡途徑[16]。有趣的是本研究發(fā)現，RPE細胞損傷后CHOP蛋白表達趨勢并不是持續(xù)增高，而是呈現2個高峰，分別在損傷后6 h和48 h。我們推測第一個高峰可能是由于A2E及藍光急性損傷RPE細胞所致，而后RPE細胞啟動一系列防御機制，包括上調HSPA5激活內質網應激相關降解途徑等，在一定程度上清除有害物質，修復細胞功能，維持RPE細胞穩(wěn)態(tài)。然而隨著時間延長，損傷超過RPE細胞代償能力，最終走向內質網應激介導的凋亡途徑。

本研究結果還表明，當基因干擾HSPA5表達時，內質網應激介導的凋亡相關分子CHOP和Caspase-12蛋白表達增高，并且加重了A2E及藍光對RPE細胞的損傷。這一結果表明內質網應激發(fā)生時，HSPA5具有部分抵抗凋亡蛋白CHOP和Caspase-12的作用，減輕A2E及藍光對RPE細胞的損傷。有研究認為，HSPA5激活是細胞在面對應激時一種重要的防御機制，該機制對細胞有保護作用[17]。在腫瘤研究中發(fā)現，癌細胞的HSPA5水平普遍較正常細胞高，它可能參與降低細胞毒性T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，抵抗癌細胞凋亡[18]。在年齡相關性神經退行性疾病研究中也發(fā)現，抑制HSPA5可以增加神經元對β淀粉樣蛋白誘導的細胞凋亡的敏感性，而提高HSPA5表達則可以保護海馬部位神經元，減輕β淀粉樣蛋白沉積對其造成的損傷[19-20]。

綜上所述，內質網應激參與A2E聯合藍光誘導的RPE細胞損傷。HSPA5具有調控內質網應激反應，減輕A2E及藍光誘導的細胞損傷，促進RPE細胞存活的作用。本研究初步揭示了AMD中RPE細胞損傷機制，為今后早期干預，增強細胞內源性保護和代償機制提供了理論依據，也為AMD潛在治療靶點研究提供了新思路。