黃芪多糖含量的相關(guān)種植因素研究

王吉利，趙艷龍

1.陜西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科(西安710082)；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院腎病醫(yī)院血液透析室(西安 710003)

黃芪是中醫(yī)藥中常用的滋補(bǔ)類(lèi)藥材，具有健脾升陽(yáng)、保肝利尿、脫毒生肌、抗衰老、降血壓、增強(qiáng)免疫功能等功效[1]。國(guó)內(nèi)市場(chǎng)中約50%被用于生產(chǎn)飲品，其余則用于中成藥及提取物等的制備[2]。近年來(lái)，隨著市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大，野生環(huán)境破壞等，野生黃芪資源越來(lái)越少，市場(chǎng)中多以栽培為主，且市場(chǎng)流通的黃芪質(zhì)量參差不齊，尚無(wú)統(tǒng)一的黃芪質(zhì)量衡量標(biāo)準(zhǔn)[3]。黃芪依據(jù)種源不同主要分為兩大類(lèi)莢膜黃芪和蒙古黃芪。西藏、甘肅、四川、東北等省區(qū)是莢膜黃芪主產(chǎn)區(qū)；山西、內(nèi)蒙、黑龍江等為蒙古黃芪主產(chǎn)區(qū)[4-5]。黃酮類(lèi)、皂苷、氨基酸和多糖等是黃芪中的主要藥理成分。其中黃芪多糖屬于大分子物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血糖、神經(jīng)和內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)及免疫調(diào)節(jié)等功效，因此其含量可作為衡量黃芪質(zhì)量的重要因素之一[6-7]。為探討黃芪產(chǎn)地、種植方式、采收時(shí)期對(duì)黃芪質(zhì)量的影響，筆者采用紫外分光光度計(jì)法對(duì)不同產(chǎn)地、種植方式和采收期黃芪中多糖成分含量進(jìn)行定量分析，以期為黃芪質(zhì)量控制提供科學(xué)的參考依據(jù)。

材料和方法

1 材 料

1.1 試劑：D-無(wú)水葡萄糖(產(chǎn)品編號(hào)P0867，純度≥98%(HPLC)，上海優(yōu)純生物供應(yīng))；乙醇、甲醇均為分析純；水為自制蒸餾水。21批黃芪藥材均經(jīng)筆者鑒定為真品。21批黃芪中7批購(gòu)自于山西、5批購(gòu)自于內(nèi)蒙、3批購(gòu)自于東北、2批購(gòu)自于甘肅、2批購(gòu)自于安徽、2批購(gòu)自于陜西；10批栽培、9批野生、2批半野生；10批栽培種植的黃芪中3批2年采收、3批3年采收、2批4年采收、1批5年采收、1批6年采收。黃芪藥材在60℃下烘干粉碎，過(guò)80目篩，密封待用。

1.2 儀器：ES-E110A型電子分析天平(天津市德安特傳感技術(shù)有限公司)；UV1901PCS雙光束紫外分光光度計(jì)(陜西瑞麗儀器設(shè)備有限公司)；HH-S8 8孔水浴鍋(上海一凱儀器設(shè)備有限公司)；MCD2000型臺(tái)式高速離心機(jī)(購(gòu)于成都勝拓儀器有限公司)；DHG-9070型數(shù)顯電熱恒溫干燥箱(杭州三永德儀器儀表有限公司)。

2 方 法

2.1 樣品溶液制備：對(duì)照樣品溶液：取適量無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品置于105℃干燥箱內(nèi)干燥至恒重后，分析天平精密稱取25 mg，加入蒸餾水溶解，并用50 ml容量瓶定容至50m l，備用。供試品溶液：分析天平精密稱取2.0 g各批供試黃芪樣品，加入200 ml錐形瓶中，加35 ml蒸餾水混合均勻，并調(diào)節(jié)pH至9.0；1000Hz、80℃下進(jìn)行多糖超聲提取，持續(xù)20 min；收集提取液，于3000 r/min條件下低溫超速離心分離，20 min后分離上清。重復(fù)上次步驟2次，合并上清；藥渣中添加適量蒸餾水，沖洗3次，合并液體；上述液體置入布氏漏斗中進(jìn)行抽濾；60℃下對(duì)抽濾結(jié)果進(jìn)行干燥濃縮，濃縮后提取物用蒸餾水溶解，并定容至50 ml，備用。

2.2 試驗(yàn)線性關(guān)系考察：用移液槍精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.4、2.0、2.6 ml對(duì)照品溶液于10 ml容量瓶中，加蒸餾水搖勻定容。采用移液槍吸取上述不同濃度的對(duì)照品溶液各2.0 ml，移至10 ml帶塞玻璃試管中；依次加入1.0 ml新制備的濃度為5.5%的苯酚溶液、5 ml濃硫酸，震蕩，隨后靜置10 min；水浴鍋中沸水加熱15 min；轉(zhuǎn)至冷水水浴鍋中冷卻20 min，490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定并記錄上述制備品吸光度。選擇對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)吸光值為縱坐標(biāo)繪制無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得對(duì)照品葡萄糖回歸方程為：y=4.614x-0.0745，R2=0.9982。表明，對(duì)照品所用無(wú)水葡萄糖溶液在濃度為0.01-0.13 mg/ml范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

2.3 儀器精密度考察：移液槍精密量取2.0 ml對(duì)照樣品溶液，重復(fù)2中“依次加入1.0 ml新制備的濃度為5.5%的苯酚溶液”至“轉(zhuǎn)至冷水水浴鍋中冷卻20 min”操作步驟。同樣于490 nm條件下，測(cè)定吸光值。重復(fù)以上操作5次。待測(cè)樣品平均吸光值為0.468，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.75%。表明，試驗(yàn)所用分光光度計(jì)具有良好精密度。

2.4 供試品穩(wěn)定性考察：移液槍精密量取2.0 ml不同批供試品溶液，重復(fù)2中“依次加入1.0 ml新制備的濃度為5.5%的苯酚溶液”至“轉(zhuǎn)至冷水水浴鍋中冷卻15 min”操作步驟。并在制備溶液靜置0、2、4、6、8、16、24 h時(shí)測(cè)定各樣品吸光值。計(jì)算結(jié)果顯示其RSD值為0.51%。表明，各批供試品溶液在24h內(nèi)具有良好穩(wěn)定性

2.5 試驗(yàn)重復(fù)性考察：分析天平精確稱取各批黃芪藥品2.0 g，每批稱取6份。按照1.2中黃芪多糖提取方法制備各批藥材試驗(yàn)溶液。重復(fù)2中“依次加入1.0 ml新制備的濃度為5.5%的苯酚溶液”至“轉(zhuǎn)至冷水水浴鍋中冷卻15 min”操作步驟。隨后在490 nm條件下測(cè)定各批樣品吸光值。計(jì)算結(jié)果顯示其RSD值為1.96%。RSD值<5%，表明各批供試品具有良好重復(fù)性。

2.6 樣品加樣回收率考察：取已知含量樣品5份(含量4.62%)，分析天平精確各稱取5g，加入精密稱取的4.5 g無(wú)水葡萄糖對(duì)照品。按照上述步驟制備供試品溶液。重復(fù)2中“依次加入1.0 ml新制備的濃度為5.5%的苯酚溶液”至“轉(zhuǎn)至冷水水浴鍋中冷卻15 min”操作步驟。隨后在490 nm條件下測(cè)定其吸光值。計(jì)算顯示多糖含量為4.51%，回收率為97.66%，RSD值為0.65%。

2.7 樣品含量測(cè)定：采用移液槍精確量取1.2制備的各供試品溶液0.1 ml，置于10 ml容量瓶中；同時(shí)量取各供試品溶液1.0 ml，置于試管中。用移液槍分別向上述量取溶液中加入1.0 ml蒸餾水。重復(fù)2中“依次加入1.0 ml新制備的濃度為5.5%的苯酚溶液”至“轉(zhuǎn)至冷水水浴鍋中冷卻15 min”操作步驟。隨后在490 nm條件下測(cè)定其吸光值。每個(gè)樣品做3個(gè)平行試驗(yàn)，取其平均值記為該批黃芪中多糖的吸光值，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算其中多糖含量。

結(jié) 果

1 不同產(chǎn)地黃芪藥材中總多糖含量 山西產(chǎn)黃芪中總多糖含量最高，達(dá)到189.25 mg/g。其次，依次為內(nèi)蒙、東北、甘肅、陜西，安徽最低(128.75 mg/g)。山西產(chǎn)黃芪中總多糖含量高出內(nèi)蒙7.38%，高出東北16.28%，高出甘肅23.69%，高出陜西29.18%，高出安徽36.15%；內(nèi)蒙高出東北8.29%，甘肅15.20%，陜西20.31%，安徽26.98%；東北高出甘肅6.37%，陜西11.09%，安徽17.09%；甘肅高出陜西4.44%，安徽10.07%；陜西高出安徽5.40%。見(jiàn)表1。

表1 不同產(chǎn)地黃芪藥材中總多糖含量

2 不同種植方式黃芪藥材中總多糖含量 人工栽培黃芪中總多糖含量最高達(dá)198.50 mg/g，其次為野生、半野生。人工栽培黃芪中總多糖含量高出野生品4.20%，高出半野生品13.59%；野生品黃芪多糖高出半野生品9.01%。見(jiàn)表2。

表2 不同種植方式黃芪藥材中總多糖含量

3 不同采收時(shí)期黃芪藥材中總多糖含量 栽培3年采收黃芪中總多糖含量最高，達(dá)201.00mg/g，其次依次為2年、4年、5年、6年。采收期為生長(zhǎng)3年黃芪中總多糖高出2年生3.88%、4年6.77%、5年20.72%、6年27.62%；采收期2年黃芪總多糖含量高出生長(zhǎng)4年2.79%，高出5年16.22%，高出6年22.86%；采收期4年黃芪總多糖含量高出生長(zhǎng)5年13.06%，高出6年19.52%；5年生黃芪中多糖高出6年生5.71%。見(jiàn)表3。

表3 不同采收時(shí)期黃芪藥材中總多糖含量

討 論

黃芪多糖是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根經(jīng)提取、濃縮、純化而成的水溶性雜多糖。淡黃色，粉末細(xì)膩，均勻無(wú)雜質(zhì)，具引濕性。黃芪多糖由己糖醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等組成，可作為免疫促進(jìn)劑或調(diào)節(jié)劑，同時(shí)具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、抗應(yīng)激、抗氧化等作用。黃芪多糖是黃芪發(fā)揮作用的主要成分。黃芪有益氣固表、斂汗固脫、托瘡生肌、利水消腫之功效。用于治療氣虛乏力，中氣下陷，久瀉脫肛，便血崩漏，表虛自汗，癰疽難潰，久潰不斂，血虛萎黃，內(nèi)熱消渴，慢性腎炎，蛋白尿，糖尿病等。黃芪多糖作為黃芪的主要藥理成分之一，具有增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞代謝和機(jī)體免疫力，促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞合成細(xì)胞DNA，雙向調(diào)節(jié)人體血糖等作用?，F(xiàn)代藥理研究顯示，黃芪多糖可通過(guò)下調(diào)細(xì)胞外型號(hào)調(diào)節(jié)激酶蛋白(ERK1/2)表達(dá)，抑制ERK1/2磷酸化等途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[8-11]；同時(shí)可通過(guò)下調(diào)人結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205中增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)，抑制病灶內(nèi)癌細(xì)胞分裂增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[12]。黃芪補(bǔ)氣膠囊、黃芪注射液、黃芪多糖注射液、黃芪多糖口服液、黃芪精顆粒等均是臨床常用的治療藥物,黃芪品質(zhì)直接影響其制劑的藥效[13-16]。因此，評(píng)價(jià)黃芪品質(zhì)，優(yōu)選高質(zhì)量藥材對(duì)提高療效，改善患者預(yù)后具有重要意義。

本研究對(duì)來(lái)自于山西、內(nèi)蒙、東北、甘肅、陜西、安徽6個(gè)省市地區(qū)的21批黃芪中黃芪多糖含量進(jìn)行測(cè)定，分析產(chǎn)地、種植方式、采收期對(duì)黃芪多糖的影響。結(jié)果顯示，山西產(chǎn)黃芪中總多糖含量最高，其次依次為內(nèi)蒙、東北、甘肅、陜西，安徽最低，該結(jié)果與付娟在黃芪多糖測(cè)定中的結(jié)果基本一致[17]。表明，山西和內(nèi)蒙黃芪品質(zhì)最好，該結(jié)論與周鵬通過(guò)測(cè)量黃芪中黃酮類(lèi)成分所得結(jié)論一致[18]。植物學(xué)方面的研究顯示，平均氣溫和晝夜溫差是影響植物多糖合成的主要?dú)庀笠蜃覽19-20]。黃芪喜性涼爽、怕熱怕澇，適合腐殖質(zhì)豐厚、透水性強(qiáng)的沙土生長(zhǎng)。山西、內(nèi)蒙、東北等地區(qū)氣候涼爽、晝夜溫差大，降雨量相對(duì)較少，因此更適宜黃芪生長(zhǎng)及多糖合成。種植方式分析顯示，人工栽培品黃芪多糖含量最高，其次為野生，半野生最低。分析原因：隨著市場(chǎng)對(duì)黃芪需求量的增加，對(duì)黃芪品質(zhì)要求的提高，不斷有新的高品質(zhì)高產(chǎn)量黃芪品種被選育出來(lái)，所以人工栽培品種多為品質(zhì)較好和(或)產(chǎn)量較高的優(yōu)良品種；種植戶也會(huì)依據(jù)黃芪自身喜性選擇光照、水分、土壤酸堿度更為適宜的土地進(jìn)行藥材種植；并給及時(shí)施肥、除草等管理，因此黃芪品質(zhì)優(yōu)于野生品；而半野生則為野生品種的試種植品種，或預(yù)選育品種，現(xiàn)有栽培條件不一定為最適宜生存條件，因此品質(zhì)最差。但該結(jié)果與張艷賀等[21]的結(jié)果存在差異，其研究顯示，野生黃芪中黃芪多糖含量最高。分析原因；可能是研究所測(cè)樣品種類(lèi)差異太大所致，本研究所選試驗(yàn)品種野生品批次(9批)與人工栽培批次基本相同(10批)，所測(cè)多糖含量為多批次的平均值；而張艷賀的報(bào)道中野生品9批、人工栽培僅2批，人工栽培批數(shù)太少，不具有代表性。不同采收期分析顯示，3年生黃芪中多糖含量最高，2年次之，3年后隨著生長(zhǎng)年限延長(zhǎng)，其多糖逐年下降，該變化趨勢(shì)與黃芪中皂苷類(lèi)化合物含量變化趨勢(shì)基本一致[22]。提示，生長(zhǎng)2～4年為黃芪最佳采收期。分析原因，黃芪生長(zhǎng)時(shí)間過(guò)久，則其株芯部位會(huì)慢慢木質(zhì)化，植株合成的多糖等物質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)換為木質(zhì)素，因此其多糖含量越來(lái)越少。

綜上所述，黃芪產(chǎn)地、種植方式和采收期是影響其質(zhì)量的主要因素，其中山西、內(nèi)蒙、東北等地區(qū)人工栽培的3年生黃芪中黃芪多糖含量較豐富，具有較好的藥用價(jià)值。因此，醫(yī)療單位在用藥選擇或制藥廠在原料選擇時(shí)，均可重點(diǎn)選擇上述地區(qū)人工栽培的3年生黃芪。