桃紅四物湯對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠治療作用及其機(jī)制研究

邱 勇

三峽大學(xué)中醫(yī)醫(yī)院(宜昌市中醫(yī)醫(yī)院)(宜昌 443000)

肝纖維化是由各種致病因素引起肝細(xì)胞損傷，導(dǎo)致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生并相對(duì)可逆的病理改變過(guò)程，是各種慢性肝病進(jìn)展為肝硬化的前期階段[1-2]。因此，在該階段進(jìn)行干預(yù)治療，對(duì)肝硬化的防治具有重要意義[3]。中醫(yī)藥在對(duì)肝纖維化的治療中有明顯的優(yōu)勢(shì)，主要以活血化瘀為主。其中，桃紅四物湯在臨床上廣泛應(yīng)用于肝纖維化患者，具有良好的療效[4-5]。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)從動(dòng)物水平探討桃紅四物湯對(duì)肝纖維化的影響及可能存在的作用機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明小鼠50只，雌雄各半，體重18 ～ 22 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK(京)2012-0001。

2 實(shí)驗(yàn)藥物 桃紅四物湯由熟地12 g，白芍、當(dāng)歸、桃仁各9 g，川芎、紅花各6 g組成，實(shí)驗(yàn)藥材均購(gòu)于老百姓大藥房。按上述比例進(jìn)行稱(chēng)量藥物，并按傳統(tǒng)方法將中藥浸泡，武火煮沸，文火煎2次，去渣并合并濃縮至1 g/ml浸膏備用。秋水仙堿片(國(guó)藥準(zhǔn)字H53021369，規(guī)格：0.5 mg/片)。

3 實(shí)驗(yàn)試劑 CCl4(無(wú)錫市展望化工試劑有限公司，批號(hào)450105)；ALT、AST、SOD、MDA、GSH-PX試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ試劑盒均購(gòu)于上海研晶生物科技有限公司；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)于博士德生物工程有限公司。

4 實(shí)驗(yàn)儀器 電子天平(德國(guó)Sartorius)，T18勻漿機(jī)(德國(guó)IKA集團(tuán))，低速臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

5 動(dòng)物分組及給藥方法 隨機(jī)取10只小鼠為正常對(duì)照組，余40只小鼠按參考相關(guān)文獻(xiàn)[6- 7]，采用30%CCl4花生油溶液按1 μl/g腹腔注射進(jìn)行造模，2次/周，共8周，正常對(duì)照組腹腔注射等劑量的花生油。造模完成后再隨機(jī)分為模型組、秋水仙堿組(1 mg/kg)、桃紅四物湯低、高劑量組(4.25 g/kg，17 g/kg)，每組10只。造模后各組按劑量灌胃給藥，1 d1次，連續(xù)給藥6周，正常對(duì)照組及模型組予以等容量蒸餾水灌胃。末次給藥后予以禁食不禁水，24 h后予以3%水合氯醛麻醉后心臟采血，并取出肝臟備用。

6 檢測(cè)指標(biāo)

6.1 血清指標(biāo)檢測(cè):小鼠麻醉后用普通抗凝管心臟采血，后以3000 r/min離心5 min，取上清，按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)小鼠ALT、AST；取左葉肝臟加生理鹽水制作10%肝組織勻漿液，2500 r/min離心10 min，取上清，按試劑說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、SOD、MDA、GSH-PX。

6.2 病理組織學(xué)檢測(cè):用4%多聚甲醛固定小鼠肝右葉組織，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，脫水，封片后光鏡下觀察肝臟組織學(xué)改變。

結(jié) 果

1 桃紅四物湯對(duì)各組小鼠血清ALT、AST活性的影響 結(jié)果如表1所示，CCl4造模后，ALT、AST活性顯著升高(P<0.01)。治療后，秋水仙堿組及桃紅四物湯低、高劑量組的ALT、AST活性均顯著降低(P<0.01)。

表1 桃紅四物湯對(duì)各組小鼠血清ALT、AST的影響(U/L)

注：與正常對(duì)照組相比，△P<0.01；與模型組相比，◇P<0.01

2 桃紅四物湯對(duì)小鼠血清肝纖維化指標(biāo)的影響 結(jié)果表明，正常組與模型組相比，模型組HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，秋水仙堿組及桃紅四物湯高劑量組HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量明顯降低(P<0.05)；桃紅四物湯低劑量組中HA、PC-Ⅲ的含量改變不明顯(P>0.05)，LN、C-Ⅳ含量明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

3 桃紅四物湯對(duì)小鼠肝臟病理組織學(xué)的影響 常規(guī)肝組織HE染色可見(jiàn)，正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)及肝細(xì)胞正常，無(wú)膠原纖維增生或炎癥浸潤(rùn)。模型組可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)不清，部分肝細(xì)胞彌漫性水腫、壞死及脂肪變性，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管區(qū)可見(jiàn)大量纖維組織增生，假小葉形成。與模型組相比，秋水仙堿組及桃紅四物湯低、高劑量組各組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞程度降低，肝細(xì)胞水腫、壞死、變性及炎癥浸潤(rùn)也減少，纖維組織增生及假小葉也得到改善(圖1)。

4 桃紅四物湯對(duì)小鼠肝組織內(nèi)SOD、MDA、GSH-PX含量的影響 由表3可知，CCl4造模后，模型組SOD、GSH-PX明顯降低(P<0.01)，MDA明顯升高(P<0.01)，經(jīng)治療后，秋水仙堿及桃紅四物湯高劑量組SOD、GSH-PX含量均顯著上升(P<0.01)，MDA顯著下降(P<0.01)；桃紅四物湯低劑量組SOD、MDA改變不明顯(P>0.05)，但GSH-PX含量明顯上升(P<0.01)。

表2 桃紅四物湯對(duì)小鼠血清HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ的影響

注： 與正常對(duì)照組相比，△P<0.01；與模型組相比,◇P<0.01，▲P<0.05

A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：秋水仙堿組；D：桃紅四物湯低劑量組；E：桃紅四物湯高劑量組

表3 桃紅四物湯對(duì)小鼠肝組織內(nèi)SOD、MDA、GSH-PX含量的影響

注：與正常對(duì)照組相比，△P<0.01；與模型組相比，◇P<0.01,▲P<0.05

討 論

肝纖維化的病因很復(fù)雜，常見(jiàn)的主要有肝炎病毒、酒精、藥物、毒物、血吸蟲(chóng)、免疫炎癥等多種因素長(zhǎng)期損傷引起，是進(jìn)展為肝硬化及肝癌的必經(jīng)之路[8]。肝纖維化的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的全身性的病理生理過(guò)程，涉及多種細(xì)胞因子及信號(hào)通路，目前認(rèn)為，肝臟受損后，肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞被激活，分泌細(xì)胞因子，這些因子可活化肝星狀細(xì)胞(HSC)，使其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，并與多種因子結(jié)合，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)成分，由于細(xì)胞外基質(zhì)成分不斷產(chǎn)生、沉淀，遂身體發(fā)生了肝纖維化[9-10]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝纖維化多屬于“脅痛”、“黃疸”、“癥瘕”、“痞滿(mǎn)”、“積聚”等范疇，多由濕熱毒邪內(nèi)侵，導(dǎo)致肝氣郁滯，脾虛不運(yùn)，日久氣虛血瘀，進(jìn)而損傷肝腎之陰，最終導(dǎo)致正虛血瘀[11-12]。桃紅四物湯是在四物湯的基礎(chǔ)上加桃仁、紅花而成，是活血養(yǎng)血之代表方。方中桃仁、紅花、川芎、當(dāng)歸等單味藥均表明有抗肝纖維化作用[13]，臨床研究發(fā)現(xiàn)該方對(duì)肝纖維化等肝臟疾病也具有良好的治療效果[4-5]。本研究表明，桃紅四物湯可明顯降低CCl4誘導(dǎo)肝纖維模型中ALT、AST的含量，減少HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ的釋放，并能降低肝小葉結(jié)構(gòu)破壞程度，減少肝細(xì)胞水腫、壞死、變性及炎癥浸潤(rùn)，改善纖維組織增生及假小葉形成，具有明顯的護(hù)肝作用。

SOD能有效地清除活性氧和自由基，是體內(nèi)主要的抗氧化防御活性物質(zhì)；GSH-PX為分解氫過(guò)氧化物所必須的物質(zhì)，其含量多少是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要因素；MDA 是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物之一，可間接反映機(jī)體的自由基代謝變化及細(xì)胞的損傷程度。桃紅四物湯可提高CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化肝組織勻漿中SOD、GSH-PX的活性，降低MDA的水平。提示桃紅四物湯可以提高機(jī)體抗氧化能力，清除活性氧和自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧反應(yīng)，從而發(fā)揮對(duì)肝臟的保護(hù)作用。

綜上所述，桃紅四物湯對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用機(jī)制可能是通過(guò)提高肝臟抗氧化的能力，降低脂質(zhì)過(guò)氧反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。