HPLC方法同時(shí)測(cè)定疏肝止痛片中三種有效成分含量

呂 玥，湯 湧，李立言，閻 姝

為保證復(fù)方制劑的安全性與有效性,中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制的方法與手段已成為中藥現(xiàn)代化的最重要研究課題之一。疏肝止痛片是天津市南開醫(yī)院研制的具有良好臨床療效的一種中藥制劑[1]，功效為疏肝理氣，行氣止痛。臨床上主要用于早期膽系感染及膽石病引起的膽絞痛、急性膽囊胰腺炎、膽道術(shù)后綜合征等。其處方由《景岳全書·古方八陣·散陣》中的柴胡疏肝散[2]加減化裁而來，全方由白芍、陳皮、柴胡、甘草、延胡索等6味藥材組成。方中以柴胡功善疏肝解郁，為君藥；延胡索活血行氣以止痛，助柴胡以解肝經(jīng)之郁滯，并增行氣活血止痛之效，為臣藥；陳皮理氣行滯，白芍、甘草養(yǎng)血柔肝，緩急止痛，均為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥相合，共奏疏肝行氣、活血止痛之功。

筆者查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)疏肝止痛片質(zhì)量檢測(cè)多為單一指標(biāo)成分，而該藥品屬于復(fù)方制劑，僅通過單一的指標(biāo)成分不能反映出整體制劑的質(zhì)量情況，又因該制劑中部分藥材的指標(biāo)成分難于檢測(cè)，故筆者在本實(shí)驗(yàn)選擇該制劑處方中的君藥-柴胡所特有的一種成分即柴胡皂苷B2作為指標(biāo)成分，以及選擇藥材的特有成分即芍藥苷、橙皮苷作為指標(biāo)成分，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)條件以達(dá)到同時(shí)測(cè)定到三種指標(biāo)成分，以更加全面地反映制劑的質(zhì)量情況。在檢測(cè)方法的選擇上，因考慮到醫(yī)院制劑室檢驗(yàn)設(shè)備的實(shí)際情況，以及設(shè)備和人員方面受到限制，因此對(duì)于疏肝止痛片的含量測(cè)定仍然傾向于使用高效液相色譜（HPLC）方法分析，并通過多波長(zhǎng)檢測(cè)以及優(yōu)化提取方法和液相梯度洗脫條件，達(dá)到可以同時(shí)測(cè)定疏肝止痛片中多個(gè)主要指標(biāo)成分含量的要求。該方法除了可以實(shí)現(xiàn)定量測(cè)定疏肝止痛片中化學(xué)成分含量的目的外，也可以通過對(duì)疏肝止痛片白芍、陳皮、柴胡三種藥材的指標(biāo)成分含量測(cè)定，而進(jìn)一步反映疏肝止痛片的質(zhì)量情況，保證臨床用藥的安全性、有效性和藥物質(zhì)量的一致性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑試藥 Agilent 1100 高效液相色譜儀；KQ-700GDV超聲波清洗器(昆山市超聲儀有限公司)； BP211D十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（天津市泰斯特儀器有限公司）；D-37520離心機(jī)（德國(guó)賽默飛世爾）。芍藥苷對(duì)照品：批號(hào)23180-57-6，純度98.0%；柴胡皂苷B2對(duì)照品：批號(hào)58316-41-9，純度98.0%；橙皮苷對(duì)照品：批號(hào)38028-32-8，純度98.0%。均由南京森貝伽生物科技有限公司提供。疏肝止痛片樣品（批號(hào)20190109、20190315、20190325）由天津市南開醫(yī)院制劑室提供。水為純凈水，乙腈為色譜純（霍尼韋爾貿(mào)易有限公司），其余實(shí)驗(yàn)使用試劑均為分析純。

1.2 溶液的制備

1.2.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液 分別精密稱取芍藥苷對(duì)照品、橙皮苷對(duì)照品及柴胡皂苷B2對(duì)照品適量，加入80%的甲醇溶液，配制芍藥苷、橙皮苷和柴胡皂苷B2的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液20 mL，置于25 mL容量瓶中，加80%的甲醇，搖勻，即得每1 mL分別含9.56 μg芍藥苷、5.02 μg柴胡皂苷B2、9.49 μg橙皮苷的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2.2 供試品溶液 取疏肝止痛片20片，研細(xì)，過100目篩，取約0.6 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加80%乙醇溶液30 mL，50 ℃下超聲提取45 min（700W，40kHZ），放冷，5000 r/min離心10 min。取上清液，殘?jiān)?0%乙醇洗滌，混合濾液，置于50 mL容量瓶中，加80%乙醇定容，即得供試品溶液。

1.2.3 陰性對(duì)照溶液 根據(jù)疏肝止痛片處方和制備工藝，分別制備不含白芍、陳皮、柴胡藥材的陰性對(duì)照品，按照“1.2.2”項(xiàng)下方法分別制備成相應(yīng)陰性對(duì)照溶液。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：KromasiL C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.3%磷酸溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫次序見表1；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：38℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm（芍藥苷），254 nm（柴胡皂苷B2），283 nm（橙皮苷）。

表1 梯度洗脫次序

2.2 專屬性試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及不含白芍、陳皮、柴胡的陰性對(duì)照品溶液各10 μL，在“2.1”色譜條件下分別注入色譜儀進(jìn)行分析，得到相應(yīng)色譜圖，如圖1、2、3所示。在該色譜條件下，芍藥苷、柴胡皂苷B2、橙皮苷均達(dá)到良好分離，且各組分之間相不干擾。

圖1 對(duì)照品溶液色譜圖

圖2 供試品溶液色譜圖

圖3 陰性對(duì)照溶液色譜圖

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ) 備 液2 mL、2.5 mL、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL置于25 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度制成混合對(duì)照品稀釋液。按照“2.1”項(xiàng)的色譜條件對(duì)稀釋后的各混合對(duì)照品溶液及稀釋前對(duì)照品儲(chǔ)備液（共7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度）進(jìn)行測(cè)定，并以質(zhì)量濃度X (mg/mL) 為橫坐標(biāo)，峰面積Y 為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次。記錄芍藥苷、柴胡皂苷B2、橙皮苷的峰面積，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為：1.8%，1.6%，0.5%。結(jié)果表明，方法精密度良好。結(jié)果見表3。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)（n=6）

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取約0.6 g的同一批號(hào)的疏肝止痛片樣品6份，精密稱定，按照“1.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得芍藥苷、柴胡皂苷B2、橙皮苷含量的RSD值分別為0.20%，0.89%，0.21%。結(jié)果表明，此方法的重復(fù)性良好。結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)（n=6）

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于配制后0、3、6、10、16、24 h，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得芍藥苷、柴胡皂苷B2、橙皮苷含量的RSD值分別為0.25%、0.94%、1.33%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)（n=6）

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批號(hào)含量相同的疏肝止痛片樣品6份，每份約0.6g，精密稱定，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品儲(chǔ)備液。精密量取供試品儲(chǔ)備液5 mL，分別加入適量的對(duì)照品儲(chǔ)備液，定容至10 mL。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各成分的峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果芍藥苷、柴胡皂苷B2、橙皮苷的平均回收率（n=6）分別為99.3%、98.6%、100.5%；RSD值分別為0.64%、1.04%、0.54%。結(jié)果見表6。

2.8 樣品含量測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)的疏肝止痛片樣品（每片0.3 g），按照“1.2.2”項(xiàng)下條件分別制備成供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表7。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中所用到的疏肝止痛片樣品處方由6種藥材構(gòu)成，與《中華人民共和國(guó)藥典》2015版一部中所收錄的舒肝丸近乎相同，主要是在保留原方中4味藥材的同時(shí)，加入甘草及柴胡。根據(jù)所記載“舒肝丸”的含量測(cè)定方法，只檢測(cè)了其中的芍藥苷成分的含量，而單一的芍藥苷含量并不能反映產(chǎn)品的質(zhì)量情況。近幾年，對(duì)于上述的6味藥材，金林等[3]測(cè)定了白芍中芍藥苷等幾種成分的含量，并將其作為指標(biāo)成分對(duì)白芍進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)；閔宇航等[4]、李軍等[5]對(duì)柴胡中的皂苷類成分進(jìn)行測(cè)定分析；仇雪[6]對(duì)陳皮進(jìn)行了研究分析，得到橙皮苷為其主要指標(biāo)成分。依據(jù)以上文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)選定白芍、柴胡、陳皮3味藥材的指標(biāo)成分為含量測(cè)定對(duì)象，即選取疏肝止痛片三種藥材的三種有效成分進(jìn)行測(cè)定。

表6 樣品加樣回收率試驗(yàn)（n=6）

表7 含量測(cè)定結(jié)果（mg/片）

對(duì)于中藥復(fù)方制劑含量測(cè)定成分提取最常用的方法是超聲提取法和加熱回流提取法。疏肝止痛片的待測(cè)成分中芍藥苷受熱不穩(wěn)定、易水解，不宜長(zhǎng)時(shí)間回流[7]；根據(jù)所查文獻(xiàn)，柴胡皂苷不宜使用加熱回流法[8]；提取橙皮苷使用超聲提取法優(yōu)于加熱回流法[9-10]。在本實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)比了80%、60%、40%、20%乙醇的提取效果和超聲提取的時(shí)間分別為30 min、45 min的提取效果，最終發(fā)現(xiàn)在80%乙醇為提取劑超聲提取45 min可以充分提取三種有效成分。

實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相為0.3%磷酸溶液（A）-乙腈（B）。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過程中對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了篩選，考察了0.3%磷酸溶液（A）-乙腈（B）-甲醇（C）、0.5%磷酸溶液（A）-乙腈（B）及0.3%磷酸溶液（A）-乙腈（B）的可行性，結(jié)果表明前兩種流動(dòng)相的選擇并不能很好的分離各有效成分，相較而言，最后一種流動(dòng)相的選擇可以較為清晰的分離出各有效成分，沒有出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，且所出峰的峰形較好。

本實(shí)驗(yàn)在保證各組分有良好的分離度的同時(shí)盡可能縮短實(shí)驗(yàn)所用的時(shí)間，采用了梯度洗脫法[11-12]，即通過改變有機(jī)相的比例從而將分析過程分為出峰區(qū)和過渡區(qū)，在出峰時(shí)采取小梯度以提高分離度，在其過度時(shí)則采取大梯度以減小分析時(shí)間。由于實(shí)驗(yàn)的分析時(shí)間長(zhǎng)，為了改善峰的拖尾情況，將柱溫由原來的30℃提高到38℃。通過觀察實(shí)驗(yàn)的圖譜，發(fā)現(xiàn)采用梯度洗脫且柱溫為38℃、流速為1.0 mL/min時(shí)峰形較好且無拖尾。

依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015版一部[13]藥材和飲片的規(guī)定，白芍藥材以乙腈-0. 1%磷酸溶液（14:86)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 mm，理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000；陳皮藥材以甲醇-醋酸-水（35:4:61)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm，理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000；柴胡藥材以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，理論板數(shù)按柴胡皂苷a峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。綜上，選擇230 nm、254 nm、283 nm為三種有效成分的檢測(cè)波長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)建立的同時(shí)測(cè)定疏肝止痛片中3種有效成分的HPLC方法專屬性好、回收率高、精密度及重復(fù)性良好，結(jié)果均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版中質(zhì)量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則（四部9101）的要求。因此，該法可用于對(duì)“疏肝止痛片”的含量測(cè)定及質(zhì)量控制。