糜蛋白酶聯(lián)合錫類散灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎的療效及對(duì)患者炎癥反應(yīng)和免疫功能的影響

宋東旭，何洪芹，張文嶺，李亞培

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性、非特異性結(jié)直腸炎性病變，好發(fā)于直、乙狀結(jié)腸，主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉和黏液膿血便。UC發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前研究認(rèn)為，腸黏膜屏障受損、免疫應(yīng)答紊亂和細(xì)胞炎性反應(yīng)是造成UC關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1-2]。該病治療困難，目前西醫(yī)采用激素、免疫制劑和氨基水楊酸制劑為主，但長(zhǎng)期西醫(yī)治療不良反應(yīng)發(fā)生率升高，耐藥性增加。而中藥對(duì)促進(jìn)潰瘍愈合，降低疾病炎癥程度有獨(dú)到優(yōu)勢(shì)，故中西醫(yī)結(jié)合治療尤顯重要。本研究收集2013年1月—2017年6月在滄州市人民醫(yī)院確診為UC的158例患者資料，觀察對(duì)比糜蛋白酶聯(lián)合錫類散保留灌腸療法對(duì)UC患者臨床癥狀的改善情況，探討該療法對(duì)患者炎癥反應(yīng)和免疫功能的影響，旨在為UC治療篩選有效藥物、方法，并提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 一般資料 收集診斷為潰瘍性結(jié)腸炎的患者158例。納入標(biāo)準(zhǔn)參照“炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見”（2012，廣州）[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：就診時(shí)存在嚴(yán)重的肝腎疾病、惡性腫瘤等嚴(yán)重系統(tǒng)性疾?。痪哂忻庖吖δ苋毕莼虻拖碌燃膊?；有嚴(yán)重并發(fā)癥，如腸道穿孔、梗阻患者；不愿參加本研究及不合作者。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組83例和對(duì)照組75例，治療組男45例，女38例，平均（45.3±14.3）歲，病變范圍分類：直腸，28人，左半結(jié)腸，29人，廣泛結(jié)腸，26人，根據(jù)Mayo[2]分級(jí)方法分為輕度31例，中度44例和重度8例。對(duì)照組男43例，女32例，平均（48.3±15.8）歲，病變范圍分類：直腸，34人，左半結(jié)腸，27人，廣泛結(jié)腸，14人，根據(jù)Mayo分級(jí)方法分為輕度27例，中度41例和重度7例。兩組間性別、年齡構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 治療方法 予兩組患者柔軟、易消化、富含維生素的高營(yíng)養(yǎng)飲食，禁忌辛辣刺激、生冷生硬飲食，同時(shí)根據(jù)病情予靜脈補(bǔ)液等支持治療。對(duì)照組給予美沙拉嗪腸溶片口服、保留灌腸，灌腸液為生理鹽水150 mL，同時(shí)加入慶大霉素80 000 IU、氟美松5 mg。治療組以此為此基礎(chǔ)，將糜蛋白酶4000 IU，錫類散3 g加至灌腸液，灌腸液溫?zé)嶂?0 ℃，藥物滴速控制在80滴/min左右，早晚各1次。治療組與對(duì)照組灌腸1周后停用慶大霉素，將氟美松減量為2.5 mg，均繼續(xù)再灌腸1周，兩組患者均以2周為1個(gè)療程，治療2個(gè)療程后復(fù)查病情。

1.3 臨床觀察指標(biāo)

1.3.1 臨床療效標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià) 根據(jù)Mayo疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分，從便血、排便次數(shù)、內(nèi)鏡發(fā)現(xiàn)、醫(yī)師總體評(píng)價(jià)方面評(píng)估UC的活動(dòng)度，3～5分為輕度，6～10分為中度，11～12分為重度。療效判定標(biāo)準(zhǔn)，參照“炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見”（2012，廣州）：（1）完全緩解：臨床癥狀消失，復(fù)查結(jié)腸鏡見黏膜大致正?；驘o(wú)活動(dòng)性炎癥；（2）有效：臨床癥狀基本消失，復(fù)查結(jié)腸鏡見黏膜輕度炎癥；（3）無(wú)效：臨床癥狀、結(jié)腸鏡復(fù)查均無(wú)改善[3]。

1.3.2 內(nèi)鏡評(píng)分 治療前后均行結(jié)腸鏡檢查，內(nèi)鏡下炎癥程度評(píng)分參考Baron分級(jí)方法：黏膜正常記錄0分；黏膜充血，血管紋理模糊記錄1分；黏膜存在接觸性出血記錄2分；黏膜存在自發(fā)性出血記錄3分；黏膜存在大小不等潰瘍且合并出血記錄4分。評(píng)分由2位內(nèi)鏡醫(yī)師共同評(píng)價(jià)。

1.3.3 不良反應(yīng)發(fā)生情況 治療期間注意患者有無(wú)便秘、腹痛及肛門墜痛等不良反應(yīng)，注意治療過(guò)程中及治療結(jié)束后患者有無(wú)肝腎功能損害。

1.4 試劑和檢測(cè)方法

1.4.1 血清炎性活動(dòng)指標(biāo)檢測(cè) 采集所有受試對(duì)象清晨空腹外周靜脈血10 mL，交由檢驗(yàn)科。魏氏法檢測(cè)ESR，散射光比濁法檢測(cè)CRP，ELISA（酶聯(lián)免疫吸附）法檢測(cè)外周血細(xì)胞因子TNF-α、IL-6。ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Genzyme公司，依試劑盒說(shuō)明書嚴(yán)格操作。

1.4.2 Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞檢測(cè) 采集所有患者清晨抗凝靜脈血5 mL，由檢驗(yàn)科應(yīng)用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞，按照熒光抗體試劑盒說(shuō)明書操作，試劑盒和熒光抗體FITC-CD4、APC-CD17和PE-CD25購(gòu)自于美國(guó)BD公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，定量資料采用表示，組內(nèi)處理前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)、組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，采用Spearman等級(jí)相關(guān)性分析做相關(guān)性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床效果比較 治療前兩組患者M(jìn)ayo評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療后治療組較對(duì)照組有效率更高，復(fù)發(fā)率更低。兩組患者M(jìn)ayo評(píng)分均下降，治療組更為顯著（P＜0.05），見表1、表2。

2.2 內(nèi)鏡評(píng)分比較 治療前兩組患者內(nèi)鏡Baron評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療后兩組患者Baron評(píng)分均下降，治療組更為明顯（P＜0.05），見表2。

表1 兩組患者臨床療效比較

表2 兩組患者M(jìn)ayo、Baron評(píng)分情況比較

2.3 不良反應(yīng)比較 兩組各有2例患者灌腸后出現(xiàn)下腹墜痛，分析原因?yàn)楣嗄c對(duì)腸道刺激反應(yīng)，均可自行緩解，未予特殊處理，兩組患者均未出現(xiàn)肝、腎功能損害等其他不良反應(yīng)。

2.4 血清炎性因子水平對(duì)比 兩組UC患者ESR、CRP、TNF-α、IL-6表達(dá)較正常人群增加，TNF-α、IL-6與Mayo分級(jí)呈正相關(guān)。治療前兩組患者ESR、CRP、TNF-α、IL-6檢測(cè)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療后各炎性因子表達(dá)均下降，治療組下降更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3、表4。

表3 UC患者ESR、CRP、TNF-α、IL-6水平表達(dá)

2.5 UC患者輔助性T細(xì)胞（Th17）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）表達(dá)水平對(duì)比 兩組UC患者Th17細(xì)胞數(shù)較正常人群增加，Treg細(xì)胞數(shù)較正常人群減少。Th17細(xì)胞與Mayo分級(jí)呈正相關(guān)，Treg細(xì)胞與Mayo分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。治療前兩組患者Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞水平無(wú)明顯差異，治療后Th17細(xì)胞數(shù)下降，Treg細(xì)胞數(shù)上升，治療組較對(duì)照組更為明顯，見表4、表5。

表4 UC患者各亞組間TNF-α、IL-6、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞與Mayo分級(jí)相關(guān)性分析

表5 UC患者外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞表達(dá)情況

3 討論

UC的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，有學(xué)者認(rèn)為炎性細(xì)胞因子失衡在UC發(fā)病過(guò)程中起重要作用，促炎因子表達(dá)水平升高會(huì)損害腸道黏膜，導(dǎo)致該病的發(fā)生[4]，并且炎癥反應(yīng)程度高低和患者的病情以及預(yù)后等都具有相關(guān)性[5]。TNF-α由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是炎癥啟動(dòng)因子，能趨化炎性細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)水平，在機(jī)體炎癥與免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[6]。IL-6 主要由單核細(xì)胞分泌，也是一種促炎細(xì)胞因子，可以介導(dǎo)炎性反應(yīng)，且有多重免疫調(diào)節(jié)功能，對(duì)機(jī)體生理平衡的維持至關(guān)重要，亦在UC發(fā)病中扮演重要角色[7]。本研究顯示，在UC患者中，重要血清促炎因子TNF-α、IL-6 表達(dá)水平較正常人群升高，一般炎癥指標(biāo)ESR、CRP亦較正常人群升高，而且血清TNF-α、IL-6 水平與UC患者M(jìn)ayo分級(jí)呈正相關(guān)，隨疾病嚴(yán)重程度加重而表達(dá)增加。這也進(jìn)一步說(shuō)明炎性細(xì)胞因子參與UC的發(fā)病。

腸道免疫功能失調(diào)是UC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的一環(huán)，研究認(rèn)為，腸道黏膜受損后，通透性增加，腸組織長(zhǎng)期暴露于大量抗原中，導(dǎo)致腸道免疫系統(tǒng)反應(yīng)和錯(cuò)誤識(shí)別，激活巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，釋放細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致機(jī)體全身和局部免疫系統(tǒng)功能紊亂，進(jìn)而引起組織損傷而發(fā)生UC[8]。Th17細(xì)胞是一種新發(fā)現(xiàn)的輔助性淋巴細(xì)胞亞群，主要分泌IL-17。除此之外．Thl7還能夠分泌IL-6、TNF-α及IL-23等多種炎性細(xì)胞因子，在UC的發(fā)病及腸道黏膜免疫中起著重要的作用[9]。Eastaff-Leung等[10]也發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照者相比，IBD患者不僅外周血中Th17 細(xì)胞比例顯著升高，而且腸黏膜中IL-17 mRNA 表達(dá)也明顯升高，提示Th17比例增加或功能亢進(jìn)可能是導(dǎo)致IBD發(fā)病的原因之一。Treg細(xì)胞是一種具有免疫負(fù)調(diào)控作用的T淋巴細(xì)胞，一方面Treg細(xì)胞通過(guò)分泌大量IL-10、TGF-β等抗炎因子來(lái)抑制樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等釋放促炎性細(xì)胞因子，另一方面其通過(guò)負(fù)性調(diào)控來(lái)抑制Th-17細(xì)胞的生成和IL-17的分泌，進(jìn)而抑制炎癥產(chǎn)生及擴(kuò)大，維持人體腸道的免疫耐受[11]。本研究亦顯示，UC患者Th17細(xì)胞較正常人群增加，而Treg細(xì)胞較正常人群減少，而且Th17細(xì)胞數(shù)與Mayo分級(jí)呈正相關(guān)，Treg細(xì)胞數(shù)與Mayo分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也進(jìn)一步說(shuō)明Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞在UC的發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用。

UC患者主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉和黏液膿血便，癥狀反復(fù)、病程遷延，屬于癌前病變，被WHO列為難治病之一，該病治療方法雖多樣，但目前尚缺乏滿意療法。西醫(yī)治療主要以氨基水楊酸制劑、激素及抗生素為主，取得了一定療效，但激素長(zhǎng)期應(yīng)用副作用明顯，抗生素長(zhǎng)期應(yīng)用則導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)。UC好發(fā)病于直、乙狀結(jié)腸，因此局部保留灌腸可使藥物以高濃度作用于病灶，提高利用度，且腸壁黏膜吸收藥物有效成分比內(nèi)服快，可避免上消化道酸堿度和消化酶對(duì)藥物的影響，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間。即使對(duì)病灶位于近端結(jié)腸者，藥物仍可通過(guò)腸道黏膜毛細(xì)血管入血起效。但是美沙拉嗪、康復(fù)新等灌腸液費(fèi)用昂貴，長(zhǎng)期應(yīng)用不良反應(yīng)也隨之出現(xiàn)，故臨床更為需要經(jīng)濟(jì)實(shí)用的治療藥物。

糜蛋白酶是從牛胰腺提取的一種蛋白分解酶，能分解肽鏈，溶解膿液，分解壞死組織、血凝塊，清潔凈化創(chuàng)面，并減輕組織水腫、消退炎癥，同時(shí)可加速肉芽生長(zhǎng)及創(chuàng)面愈合。錫類散具有清熱解毒、去腐生肌功效。實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為，錫類散能改善患者TLR4表達(dá)及核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB活化水平，減少炎性細(xì)胞因子釋放，抑制炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)，起到修復(fù)黏膜、愈合潰瘍面的作用[12]。前期糜蛋白酶緩解UC急性期病變，起到“清理戰(zhàn)場(chǎng)”的鋪墊作用，以此為基礎(chǔ)錫類散可直接作用于創(chuàng)面，進(jìn)一步發(fā)揮抗炎、抑制免疫反應(yīng)作用。故糜蛋白酶與錫類散具有相互補(bǔ)充的作用，糜蛋白酶使錫類散的抗炎作用達(dá)到了最大化。本研究顯示，治療組較對(duì)照組患者臨床癥狀改善更為明顯，總有效率更高，Mayo評(píng)分、內(nèi)鏡評(píng)分下降更為顯著，充分說(shuō)明了糜蛋白酶聯(lián)合錫類散保留灌腸療法的臨床有效性。

本研究顯示，治療后兩組患者血清ESR、CRP、TNF-α、IL-6表達(dá)水平下降，治療組更為顯著，表明糜蛋白酶聯(lián)合錫類散保留灌腸療法抑制了血清炎性因子ESR、CRP、TNF-α、IL-6的表達(dá)，分析原因，早期糜蛋白酶凈化創(chuàng)面的作用，使錫類散更充分的作用于創(chuàng)面，起到抗炎作用，而炎癥的消退又促進(jìn)了腸黏膜的修復(fù)。本研究亦顯示，治療后兩組患者Th17細(xì)胞下降，Treg細(xì)胞上升，治療組更為顯著，提示改善腸道免疫功能可能是糜蛋白酶聯(lián)合錫類散保留灌腸療法作用的一個(gè)靶點(diǎn)，糜蛋白酶的“清創(chuàng)”和錫類散的“抗炎”改善了腸道的炎性環(huán)境，通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子的釋放，調(diào)控了免疫細(xì)胞水平、糾正了腸黏膜免疫功能紊亂狀態(tài)。

糜蛋白酶聯(lián)合錫類散保留灌腸療法臨床效果顯著，調(diào)控UC患者炎性細(xì)胞因子水平，恢復(fù)腸黏膜的免疫平衡狀態(tài)可能是其作用機(jī)制。UC發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，故糜蛋白酶聯(lián)合錫類散保留灌腸療法的作用靶點(diǎn)需進(jìn)一步研究。