沉默Notch-1基因影響人膀胱癌RT4細胞生物學(xué)行為的體外實驗研究

鄭克文，潘 悅，黃 航，陳洪德，盧湧湧，吳可明，鄧哲憲，翁志梁，余志賢，陳 偉

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的生命健康。據(jù)統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)，每年新發(fā)膀胱癌患者數(shù)逾30萬，在人類常見腫瘤中位居前列[1]。非肌層浸潤性膀胱癌的治療主要以手術(shù)聯(lián)合術(shù)后膀胱灌注化療為主。由于膀胱癌發(fā)病率高且術(shù)后復(fù)發(fā)率高，因此，研究膀胱癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因并尋找潛在的治療靶點迫在眉睫。Notch-1廣泛存在于各種細胞生物學(xué)行為過程中，參與多種細胞的增殖分化。研究顯示，膀胱癌細胞中Notch1的表達量與其惡性程度呈正比[2-3]，抑制Notch-1的表達可以抑制膀胱癌細胞的增殖[4]。但Notch-1基因?qū)τ诎螂装┘毎木唧w作用機制目前尚不清楚。因此，本文以人膀胱癌RT4細胞為研究對象，通過沉默Notch-1，觀察其對RT4細胞增殖、侵襲、凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等生物學(xué)行為的影響，為臨床治療膀胱癌提供潛在靶點及相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人膀胱癌RT4細胞（中國科學(xué)院上海細胞庫）；TEMED、丙烯酰胺（Amreso公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、磷酸酶抑制劑（上海碧云天公司）；PLVX-shRNA2載體（美國Addgene公司）；Trizol試劑，限制性內(nèi) 切 酶EXORI、BamHI（美 國Thermo Fisher公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒（大連Takara公司）；兔單抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2（美國CST公司）；兔多抗Bad、兔單抗Bid（英國Abcam公司）；Transwell小室（美國BD公司）；細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒（南京凱基生物有限公司）。

1.2 細胞的復(fù)蘇、培養(yǎng) 將人膀胱癌RT4細胞從-80℃冰箱取出后，按照“慢凍速溶”原則進行復(fù)蘇，將細胞置于事先升溫至37 ℃ 的水浴鍋中使其融化，融化時間不超過1 min，然后將細胞分別培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基（100 U/mL青霉素和0.1 mg/L的鏈霉素），并置于37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.3 質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 本試驗所用干擾序列于吉瑪生物合成，序列如下：Notch1-shRNA上游序列：GATCCCCAACATCCAGGACAACATTTCAA GAGAATG TTGTCCTGGATGTTGGTTTTTTCT CGAGG，下 游 序 列：AATTCCTCGAGAAAA AACCAACATCCAGGACAACATTCTCTTG AAATGTTGTCCTGGATGTT GGG；shRNANc上 游 序 列：GATCCTTCTCCGAACGTGTC ACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTCGGA GAATTTTTTCTCGAGG，下游序列：AATTCCTC GAGAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCT CTTG AAACGTGACACGTCGGAGAAG。序列退火成雙鏈后，連接克隆到經(jīng)EXORI、BamHI酶切的PLVX-shRNA2載體上。然后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌DH5α后，挑單克隆提取質(zhì)粒并行測序分析，驗證得到正確克隆的質(zhì)粒。取對數(shù)生長期細胞于24孔板中，調(diào)整細胞濃度，使每個孔中的細胞數(shù)約為4×105個，在細胞融合度為70%～80%時進行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書對RT4細胞進行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染8 h后更換含有氨芐青霉素（30 μg/mL）的培養(yǎng)基，繼續(xù)于含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后取出培養(yǎng)板，收集細胞進行后續(xù)實驗，并用RT-PCR法分別檢測T24細胞中Notch-1的表達。實驗共分為2組，分別為Notch-1陰性對照組（shRNA NC），Notch-1干擾組（Notch-1 shRNA）。

1.4 MTT檢測細胞增殖變化 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度到5×104個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL細胞懸液，置于5% CO2，37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，然后向每孔中加入10 μL的MTT檢測液，37 ℃培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)基，加入150 μL的DMSO震蕩10 min，然后將96孔板置于酶標(biāo)儀中，于568 nm波長處測定各孔的吸光度。

1.5 Transwell法檢測細胞侵襲能力變化 將轉(zhuǎn)染成功后繼續(xù)培養(yǎng)48 h的各組細胞分別用0.25%的胰蛋白酶進行消化收集，1000 r/min離心5 min，棄上清，用預(yù)冷的PBS清洗2次，然后在無血清培養(yǎng)基中對細胞進行重懸，采用細胞計數(shù)板進行計數(shù)，然后在24孔板中加入含有10% FBS的培養(yǎng)基，在Transwell小室上室底部中央垂直加入100 μL終濃度為1 mg/mL的Matrigel，待Matrigel凝固后在Transwell上室分別加入200 μL的細胞懸液，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后取出Transwell，用PBS小心清洗小室，用10%甲醇溶液對細胞進行固定30 min，然后切下膜，滴入5%結(jié)晶紫染液，室溫靜置20 min后，顯微鏡下進行觀察拍照。

1.6 流式細胞術(shù)檢查細胞凋亡的變化 取轉(zhuǎn)染繼續(xù)培養(yǎng)48 h后的各組細胞，用0.25%胰酶消化，充分吹打混勻細胞懸液并收集至流式專用管中；取約105個重懸細胞，1200×g，4℃離心5 min，棄上清；加入1 mL預(yù)冷PBS進行重懸，1200×g，4 ℃離心5 min，棄上清，重復(fù)兩次；按照AnnexinVAPC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行檢測，將細胞重懸于50 μL binding buffer，加入5 μL 7-AAD，輕輕混勻，4 ℃，避光孵育15 min；再加入450 μL binding buffer，混勻，加入1 μL Annexin V-APC混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min，然后進行流式細胞儀上機檢測。

1.7 RT-PCR檢測E-cadherin、N-cadherin、vimentin、Bcl-2、Bad、Bid mRNA表達情況 轉(zhuǎn)染后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用Trizol法提取各組細胞的總RNA，然后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的cDNA。利用Real-time PCR檢測E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bad、Bid mRNA表達水平（引物序列見表1），PCR反應(yīng)程序：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s，40個循環(huán)；65 ℃，5 min；95 ℃，50 s。以GAPDH作為內(nèi)參，結(jié)果采用2-△△Ct法進行分析。

表1 引物序列表

1.8 Western blot檢 測E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bad、Bid蛋白表達情況 轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h，然后收集并提取各組細胞的蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒對所提取的蛋白進行濃度測定。然后取20 μg蛋白與4 μL 2×SDS上樣緩沖液混合均勻，100 ℃變性10 min，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂奶粉制成的封閉液進行封閉2 h，加入稀釋后的 一 抗（Bcl-2：1∶1000；Bad：1∶500；Bid：1∶1000；Vimentin：1∶1000；E-cadherin：1∶500；N-cadherin：1∶1000；GAPDH：1∶1000），4 ℃孵育過夜，PBS洗膜后，加入HRP標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG（1∶50000），室溫孵育1 h，然后用ECL化學(xué)發(fā)光檢測，以目的蛋白光密度值／內(nèi)參蛋白光密度值作為目的蛋白的光密度值，重復(fù)3次獨立試驗。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Notch-1 shRNA載體構(gòu)建 如圖1所示，構(gòu)建的Notch-1 shRNA載體經(jīng)測序分析表明插入的序列及位點正確，目的基因Notch-1的干擾載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 Notch-1 shRNA載體質(zhì)粒測序鑒定

2.2 兩組細胞Notch-1的表達變化 為了研究Notch-1在人膀胱癌RT4細胞中的作用，我們采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法抑制了RT4細胞中Notch-1的表達，然后采用RT-PCR檢測兩組細胞中Notch-1的表達。結(jié)果如圖2所示，與RT4+shRNA NC組相比，RT4+Notch-1 shRNA組的Notch-1 mRNA表達量明顯下降（t=10.004，P＜0.001）。

2.3 沉默Notch-1對膀胱癌RT4細胞增殖率的影響 結(jié)果如圖3所示，與RT4+shRNA NC組相比，RT4+ Notch-1 shRNA組細胞增殖率明顯降低（t=4.629，P=0.010）

圖2 兩組細胞Notch-1的表達水平變化

圖3 兩組細胞增殖率變化

2.4 沉默Notch-1對人膀胱癌RT4細胞的侵襲能力的影響 如圖4所示，與陰性對照組（RT4+shRNA NC）相 比，Notch-1干 擾 組（RT4+Notch-1 shRNA）的遷移細胞數(shù)目明顯減少（t=8.193，P=0.001）。

2.5 沉默Notch-1促進膀胱癌RT4細胞的凋亡 為了研究沉默Notch-1對人膀胱癌細胞凋亡的改變，我們采用流式細胞術(shù)對人膀胱癌RT4細胞進行了檢測。結(jié)果如圖5所示，與RT4+shRNA NC組相比，RT4+Notch-1 shRNA組的細胞凋亡率顯著上升（t= -18.441，P＜0.001）。

2.6 沉默Notch-1對膀胱癌RT4細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bad、Bid mRNA表達的影響 如圖6所示，與RT4+shRNA NC組比 較，RT4+Notch-1 shRNA組 中E-cadherin（t=-13.457，P＜0.001）、Bad（t= -12.521，P＜0.001）、Bid（t= -9.231，P＜0.001）的mRNA表達量顯著升 高，N-cadherin（t=6.505，P＜0.001）、Vimentin（t=9.135，P＜0.001）、Bcl-2（t=10.651，P＜0.001）mRNA表達量顯著降低。

2.7 沉默Notch-1對膀胱癌RT4細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bad、Bid蛋 白 的影響 我們對人膀胱癌RT4細胞的凋亡及侵襲遷移相關(guān)蛋白表達水平進行了檢測，結(jié)果如圖7顯示，與陰性對照組相比，干擾組E-cadherin（t=-5.610，P=0.005）、Bad（t= -6.983，P=0.002）、Bid（t= -8.871，P=0.001）蛋白表達量顯著升高，N-cadherin（t=10.132，P=0.001）、Vimentin（t=5.630，P=0.005）、Bcl-2（t=6.973，P=0.002）蛋白表達量顯著降低。

圖4 兩組遷移細胞數(shù)量變化（×200）

圖5 兩組細胞凋亡率的變化

圖6 兩組細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bad、Bid mRNA表達水平變化

圖7 兩組細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bad、Bid蛋白表達量變化

3 討論

Notch信號通路大量存在于哺乳動物的體內(nèi)，參與著體內(nèi)眾多的生命活動調(diào)節(jié)：維持細胞的分化、增殖和凋亡的動態(tài)平衡[5-6]。Notch信號通路由Notch受體、Notch配體及細胞內(nèi)效應(yīng)器分子所組成，Notch受體包括4種受體，分別為Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4、Notch配體 包 括JAG1、JAG2、DLL1、DLL3和DLL4。Notch信號通路的異?？梢哉T導(dǎo)多種腫瘤的發(fā)生，其中，Notch-1的異常表達在腫瘤組織中最常被發(fā)現(xiàn)。Notch-1可以通過影響相鄰細胞之間的信息傳遞來維持干細胞的特性。Notch-1還可以通過影響細胞的增殖、分化和凋亡來參與各種類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-8]。李偉等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Notch-1能夠促進乳頭狀癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。郝俊龍等[10]發(fā)現(xiàn)，抑制Notch-1的表達能夠抑制骨肉瘤細胞的生長。Shi等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌中，Notch-1的表達量隨著膀胱癌的病理分級升高而逐漸增加，腫瘤的生長與凋亡密切相關(guān)。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用，Bcl-2基因是一種原癌基因，能夠改變線粒體外膜的通透性，抑制細胞色素C釋放到細胞質(zhì)，從而阻止Caspase的活化級聯(lián)，進而抑制細胞凋亡[11]。當(dāng)Bcl-2呈高表達時，則抑制凋亡的發(fā)生；當(dāng)Bcl-2呈低表達時，則促進凋亡[11]。Bid蛋白是Bcl-2家族中唯一含有1個BH-3結(jié)構(gòu)域的重要的前凋亡分子，Bid 是促凋亡蛋白。在靜息狀態(tài)下，Bid以非激活狀態(tài)分布在胞漿中，在細胞發(fā)生凋亡的過程中，全長的Bid通過多種蛋白酶被切割形成tBid，tBid轉(zhuǎn)位到線粒體發(fā)揮凋亡功能[12]。Bad是Bcl-2相關(guān)死亡啟動子，也是參與細胞凋亡的重要調(diào)控蛋白[12]。在本研究中，Notch-1抑制組細胞的增殖率和遷移數(shù)量顯著降低，表明抑制Notch-1能抑制人膀胱癌RT4細胞增殖和遷移活動。Notch-1 shRNA組中凋亡相關(guān)蛋白Bad、Bid的表達量顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量顯著降低，提示抑制Notch-1可以促進膀胱癌細胞的凋亡，這與以上Notch-1抑制細胞凋亡的結(jié)論相符。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是指上皮細胞在某些因素的刺激下，失去極性和細胞間的緊密連接，從而獲得浸潤性和游走性遷移的能力。生理情況下，上皮細胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化可以修復(fù)受傷的正常組織。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，EMT發(fā)揮著重要的作用。轉(zhuǎn)移是腫瘤死亡的主要原因，EMT是轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)中的一個起始和重要事件，在轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)中上皮癌細胞失去極性和細胞接觸，細胞間相互作用及黏附力減弱，癌細胞的遷移能力增強，伴隨著E- cadherin等蛋白的表達下降，E- cadherin表達的降低目前已被認為是EMT最顯著的特征，可使癌細胞獲得易于侵襲的特性，Vimentin、N-cadherin等蛋白的表達升高，使得癌細胞獲得促進遷移和侵襲的間充質(zhì)特征[13]。研究發(fā)現(xiàn)，Notch-1可以通過介導(dǎo)各種EMT相關(guān)基因的表達從而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[14-15]。E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白是EMT相關(guān)蛋白。E-cadherin廣泛分布于胞膜和胞漿中，可維持上皮細胞間的緊密連接，對維持細胞的形態(tài)穩(wěn)定具有重要的作用[16]，N-cadherin則主要是介導(dǎo)神經(jīng)組織及成纖維細胞之間的黏附，Vimentin廣泛分布于細胞間質(zhì)之間。Kang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，抑制Notch-1基因可以通過促進E-cadherin的表達、抑制Vimentin的表達，從而減輕肺癌細胞的EMT[18]。研究發(fā)現(xiàn)Notch還可以通過促進N-cadherin的表達從而促進癌細胞發(fā)生EMT。因此，為了進一步研究Notch-1 shRNA是否通過抑制膀胱癌細胞EMT從而發(fā)揮其作用，我們分別采用RT-PCR和Western blot對EMT相關(guān)蛋白進行了檢測。在本實驗中，E-cadherin表達量顯著升高，N-cadherin、Vimentin表達量顯著降低。而E-cadherin與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲關(guān)系密切，且其表達量與癌癥患者的生存率呈正比[19-20]，N-cadherin和Vimentin蛋白則具有促進細胞黏附和信號傳導(dǎo)的作用[21]，提示抑制Notch-1的活性可以抑制EMT相關(guān)蛋白的表達，從而抑制膀胱癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，抑制Notch-1的表達能夠抑制人膀胱癌細胞的侵襲遷移，促進細胞凋亡，其機制可能與誘導(dǎo)Bad、Bid、E-cadherin，抑制Bcl-2、N-cadherin、Vimentin的表達有關(guān)。