褪黑素聯(lián)合順鉑促進(jìn)大鼠胰腺癌AR42J細(xì)胞凋亡

龐林榮 陳俊 陸靜爾 黃佳 徐彩虹 程曉春 李暉 周欣

浙江省寧波市鄞州人民醫(yī)院腫瘤放化療中心，寧波 315040

褪黑素具有多種生理功能[1]，它對(duì)腫瘤細(xì)胞有抗氧化性、抑瘤性和促凋亡活性，是抗癌劑或聯(lián)合治療的理想候選藥物之一[2]。大多數(shù)化療藥物是線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑的典型激活劑，且細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的大量蓄積可導(dǎo)致線粒體損傷進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[3-4]。內(nèi)源性凋亡途徑始于caspase-9的激活，然后激活caspase-3、6和7，通過下游半胱天冬酶切割特定細(xì)胞底物蛋白質(zhì)，促使細(xì)胞凋亡[5-6]。對(duì)癌癥患者的初步臨床研究表明，褪黑素可以降低腫瘤的復(fù)發(fā)率，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間[7]。然而，關(guān)于褪黑素與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制目前尚不清楚。本研究觀察褪黑素聯(lián)合順鉑對(duì)大鼠胰腺癌細(xì)胞株AR42J細(xì)胞凋亡的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

材料和方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)及分組

大鼠胰腺癌細(xì)胞株AR42J購于上海酶研生物科技有限公司，常規(guī)復(fù)蘇、傳代。實(shí)驗(yàn)分兩部分，第一部分實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、1 mmol/L順鉑處理組(順鉑組)、1 mmol/L褪黑素處理組(褪黑素組)、1 mmol/L順鉑加1 mmol/L褪黑素聯(lián)合處理組(聯(lián)合組)；第二部分實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、聯(lián)合組、1 μmol/L PBN(phenyl-N-tert-butyl nitrone，ROS抑制劑)預(yù)處理1h后順鉑加褪黑素聯(lián)合處理組(PBN+聯(lián)合組)、PBN溶劑預(yù)處理1h后順鉑加褪黑素聯(lián)合處理組(溶劑+聯(lián)合組)。藥物處理濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選獲得。

二、細(xì)胞增殖檢測(cè)

使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔2×106個(gè)細(xì)胞密度接種于24孔板，根據(jù)分組分別給予相應(yīng)的藥物處理。培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，加入含MTT的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，上酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm波長(zhǎng)的吸光度值(A490值)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取均值。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組A490值/對(duì)照組A490值×100%。

三、細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用Annexin V-FITC/PI 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，檢測(cè)試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司。各組細(xì)胞藥物處理24 h后，用含0.2%胰蛋白酶的EDTA分離細(xì)胞，PBS洗滌兩次，1 000 r/min離心5 min后棄上清液，用含有V-FITC的95 μl緩沖液重懸細(xì)胞，然后加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)，上流式細(xì)胞儀(Cytomycs FC-500，美國Beckman-Coulter公司)測(cè)細(xì)胞凋亡。每個(gè)樣本測(cè)試3次，取均值。

四、ROS水平檢測(cè)

使用2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平，DCFH-DA購于美國Molecular Probes公司。取各組培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入無血清培養(yǎng)基中稀釋的DCFH-DA，終濃度為20 μmol/L。在暗箱中37 ℃孵育30 min后用PBS洗滌細(xì)胞2次，上激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss AG，德國)測(cè)量熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)525 nm。

五、細(xì)胞caspase-3蛋白表達(dá)量檢測(cè)

取各組培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞。蛋白定量后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)caspase-3蛋白表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參?？筩aspase-3 一抗購于英國Abcam公司，工作濃度1∶500，抗β-actin一抗購于美國Santa Cruz公司，工作濃度1∶2 000， HRP耦聯(lián)羊抗小鼠或山羊抗兔抗體購于英國Abcam公司，工作濃度1∶5 000。最后在暗室中采用ECL發(fā)光液(上海愛必信生物科技有限公司)發(fā)光，膠片曝光、顯影、定影，掃描儀掃描膠片圖像，用Image J軟件分析各條帶的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白表達(dá)量，以對(duì)照組為1，計(jì)算其他組表達(dá)量的百分比。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、褪黑素聯(lián)合順鉑對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響

對(duì)照組、順鉑組、褪黑素組、聯(lián)合組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞增殖率分別為(96.29±3.49)%、(81.38±6.01)%、(80.72±3.68)%、(42.26±6.35)%；細(xì)胞凋亡率分別為(16.42±4.15)%、(56.47±9.06)%、(52.94±6.57)%、(87.36±6.48)%。順鉑組、褪黑素組的細(xì)胞增殖率較對(duì)照組均顯著降低，細(xì)胞凋亡率均顯著升高；聯(lián)合組的細(xì)胞增殖率又較順鉑組、褪黑素組顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，提示褪黑素聯(lián)合順鉑處理對(duì)大鼠胰腺癌AR42J細(xì)胞增殖抑制及凋亡的作用強(qiáng)于單獨(dú)用藥處理。

二、褪黑素聯(lián)合順鉑對(duì)細(xì)胞ROS水平的影響

對(duì)照組、順鉑組、褪黑素組、聯(lián)合組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后ROS陽性細(xì)胞占比分別為(1.33±1.53)%、(46.67±7.64)%、(45.67±5.13)%、(83.33±7.64)%。順鉑組、褪黑素組ROS陽性細(xì)胞占比較對(duì)照組顯著增加；聯(lián)合組ROS陽性細(xì)胞占比又較順鉑組、褪黑素組顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，提示褪黑素聯(lián)合順鉑處理促進(jìn)大鼠胰腺癌AR42J細(xì)胞產(chǎn)生ROS，其作用強(qiáng)于單獨(dú)用藥。

三、褪黑素聯(lián)合順鉑對(duì)細(xì)胞caspase-3表達(dá)的影響

對(duì)照組、順鉑組、褪黑素組、聯(lián)合組細(xì)胞caspase-3表達(dá)量分別為100%、(150.64±7.70)%、(147.00±7.27)%、(190.04±5.07)%。順鉑組、褪黑素組細(xì)胞caspase-3表達(dá)量較對(duì)照組顯著上調(diào)，聯(lián)合組又較順鉑組、褪黑素組進(jìn)一步顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，圖1)，提示褪黑素聯(lián)合順鉑處理促進(jìn)大鼠胰腺癌AR42J細(xì)胞caspase-3表達(dá)。

圖1 對(duì)照組(1)、順鉑組(2)、褪黑素組(3)、聯(lián)合組(4)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后caspase-3表達(dá)

四、PBN預(yù)處理對(duì)褪黑素聯(lián)合順鉑處理細(xì)胞ROS水平的影響

對(duì)照組、聯(lián)合組、PBN+聯(lián)合組、溶劑+聯(lián)合組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后ROS陽性細(xì)胞占比分別為(1.80±0.72)%、(84.90±6.13)%、(45.24±4.64)%、(86.23±6.17)%。聯(lián)合組ROS陽性細(xì)胞占比較對(duì)照組顯著增加，PBN+聯(lián)合組ROS陽性細(xì)胞占比較聯(lián)合組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，提示褪黑素聯(lián)合順鉑處理前給予ROS抑制劑PBN預(yù)處理可顯著逆轉(zhuǎn)褪黑素聯(lián)合順鉑處理所致大鼠胰腺癌AR42J細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

五、PBN預(yù)處理對(duì)褪黑素聯(lián)合順鉑處理細(xì)胞caspase-3表達(dá)的影響

對(duì)照組、聯(lián)合組、PBN+聯(lián)合組、溶劑+聯(lián)合組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后caspase-3表達(dá)量分別為100%、(184.69±7.76)%、(124.92±9.72)%、(182.02±6.79)%。聯(lián)合組caspase-3表達(dá)量較對(duì)照組顯著上調(diào)，PBN+聯(lián)合組caspase-3表達(dá)量較聯(lián)合組顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，圖2)，提示褪黑素聯(lián)合順鉑處理前給予PBN預(yù)處理可顯著逆轉(zhuǎn)褪黑素聯(lián)合順鉑所致大鼠胰腺癌AR42J細(xì)胞的caspase-3表達(dá)。

討 論

大鼠胰腺癌細(xì)胞AR42J是來源于重氮絲氨酸誘導(dǎo)大鼠胰腺生成的惡性結(jié)節(jié)，是胰腺上皮癌變[8]。文獻(xiàn)報(bào)道，褪黑素可促進(jìn)胰腺癌、肝癌和前列腺癌細(xì)胞的凋亡[9-10]，增強(qiáng)多柔比星對(duì)正常非腫瘤細(xì)胞如人角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞毒性[11]。然而褪黑素對(duì)順鉑誘導(dǎo)的人外周血單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用[12]，也不干擾阿糖胞苷、柔紅霉素和依托泊苷導(dǎo)致的白血病細(xì)胞系Jurkat、MOLT-4、Daudi、HL-60、CMK和K562的細(xì)胞凋亡[13]。

圖2 對(duì)照組(1)、聯(lián)合組(2)、PBN+聯(lián)合組(3)、溶劑+聯(lián)合組(4)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后caspase-3表達(dá)

細(xì)胞凋亡是一個(gè)重要的生理過程，在發(fā)育和組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。caspase-3的激活是細(xì)胞凋亡的重要條件[14]，然而細(xì)胞凋亡也涉及廣泛的病理?xiàng)l件。凋亡缺陷是腫瘤發(fā)生的常見事件且是耐藥的重要因素[15]，已知各種化療藥物可觸發(fā)內(nèi)源性凋亡途徑和(或)增加線粒體對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性[16-17]。

ROS包括超氧化物、單線態(tài)氧原子、過氧化氫、羥自由基和過氧化基等，可激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力等[18]。過量的活性氧會(huì)損害細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA[19]，細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積是觸發(fā)細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑的機(jī)制之一，且通常伴隨著線粒體的損傷[20]。同時(shí)，ROS是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)以保護(hù)腫瘤細(xì)胞免遭死亡[21]。許多天然藥物和合成藥物通過誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生而發(fā)揮抗腫瘤作用[22]。細(xì)胞氧化還原內(nèi)環(huán)境平衡受到活性氧耗竭系統(tǒng)和活性氧清除系統(tǒng)之間平衡的調(diào)節(jié)[23]，例如，活性氧自由基(特別是H2O2)水平的升高具有很強(qiáng)的致突變性，有助于提高細(xì)胞突變水平和異質(zhì)性，增加ROS水平可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[24]。因此增加ROS蓄積從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡是抗癌研究的重要方向。

本研究結(jié)果顯示，褪黑素聯(lián)合順鉑處理后AR42J細(xì)胞的增殖活性較單用褪黑素或順鉑處理時(shí)顯著降低，而細(xì)胞凋亡率顯著增加，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積，caspase-3表達(dá)量上調(diào)。應(yīng)用ROS拮抗劑PBN預(yù)處理后，使褪黑素聯(lián)合順鉑處理的AR42J細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降，caspase-3表達(dá)下調(diào)，說明褪黑素聯(lián)合順鉑可能通過ROS/caspase-3通路促進(jìn)胰腺癌AR42J細(xì)胞的凋亡，為胰腺癌治療和研究提供了新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突