芫荽遺傳多樣性與性狀的關聯分析

李小梅 張景濤

摘要：為掌握引進芫荽種質資源遺傳情況，選用23條引物對96份芫荽資源進行分析，在此基礎上分析其遺傳多樣性與性狀之間的關聯。結果表明，供試群體的Simpson指數為0.098～0.505，Shannon指數為0.085～0.301，種質特異指數為69.964～208.694。53個RAPD標記中有17個標記與15個性狀相關聯。與抽薹天數（DSE）、始花期（DSF）、終花期（DEF）、收獲天數（DH）、最長基生葉長（LLBL）、花期（FR）、莖中花青素（ANST）、株高（PH）、基生葉數（NBL）、植株有葉狀態(tài)（LP）、基生葉生長習性（HBL）、分枝數（NB）、果實形狀（SF）、千粒重（W1000F）和果實裂果趨勢（TSF）關聯的多態(tài)性位點分別有1、2、2、2、2、3、2、2、2、2、4、2、6、2和2個。其中，4個位點同時與兩個或2個以上性狀相關聯。

關鍵詞：芫荽;RAPD標記;遺傳多樣性;關聯分析

中圖分類號：S573+.2 ? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）21-0107-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.21.022

Abstract： In order to understand the genetic information of the introduced Coriander germplasm resources， 23 random primers were selected for the polymorphism detection of 96 materials， and the relationship between genetic diversity and traits was analyzed. The results showed that the Simpson's index of the population was 0.098～0.505， and the shannon's index was 0.085～0.301， and the specialty index was 69.964～208.694. 17 of the 53 RAPD markers were associated with 15 traits. The numbers of polymorphic markers associated with days with convulsions （DSE）， initial flowering stage （DSF）， flowering stage （DEF）， days of harvest （DH）， longest basal leaf length （LLBL）， flowering stage （FR）， anthocyanins （ANST）， strain High （PH）， basal leaf number （NBL）， plant leafy state （LP）， basal leaf growth habit （HBL）， number of branches （NB）， fruit shape （SF）， 1000-grain weight （W1000F） and fruit cracking Trend （TSF） were 1，2，2，2，2，3，2，2，2，2，4，2，6，2 and 2. Among them， 4 sites are associated with two or more traits at the same time.

Key words： Coriandrum sativum; RAPD makers; genetic diversity; association analysis

芫荽（Coriandrum sativum L.）是世界常用的香料[1]，又名香菜、鹽荽、胡荽，是傘形科草本植物，常作綠葉蔬菜，莖葉有特殊芳香味。由于其生育期短，可四季栽培，以春秋兩季栽培品質為好。芫荽具有藥用價值，根莖葉及種子均可入藥，在中東地區(qū)特別是伊朗，芫荽用于預防抽搐、失眠、焦慮等癥;在歐洲，其被作為一種治療糖尿病的藥，種子可用于助消化、輔助治療風濕病[2-10]。研究表明，芫荽具有抑菌、抗氧化、抗炎及抗糖尿病功效[11]，對緩解某些食物中毒也有一定的作用[12]。

種質資源是遺傳研究和品種改良的基礎[13]，通過對種質資源進行遺傳多樣性分析，可以指導育種，提高育種效率。在分析遺傳多樣性基礎上，挖掘有利基因，對于后期分子標記輔助選擇具有重要意義。關聯分析是以連鎖不平衡原理為基礎，鑒定群體內目標性狀與遺傳標記或候選基因關系的分析方法，已成為基因發(fā)掘研究的主要方法。關聯分析無需花費較多時間和精力去構建作圖群體，能夠有效分析等位基因對性狀的貢獻率[14-16]。已報道芫荽相關研究主要集中在種植、成分分離和功能驗證方面，相關功能因子及作用機制的研究多集中于成分分析，在分子水平上有關芫荽的研究鮮見報道。L？仵pez等[17]對芫荽表型、生化及分子多樣性進行了評價，李小梅等[18]對芫荽進行了遺傳多樣性的RAPD分析。RAPD標記應用于芫荽農藝性狀關聯分析的研究鮮見報道。本研究以96份芫荽種質資源為材料，對19個性狀進行測定與分析[19]，基于自然群體的連鎖不平衡作圖策略，進行RAPD分子標記與其農藝性狀關聯分析，旨在為后期芫荽新品種選育及分子標記輔助選擇提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? ?供試材料及生物學性狀測定

供試96份芫荽種質材料為國外資源庫引進，具體見表1。

所有材料連續(xù)兩個生長季種植于哈爾濱市農業(yè)科學院實驗基地，隨機區(qū)組設計，3次重復。對生物學性狀進行調查與測定[19]，兩個生長季各測1次，測定及賦值標準[20]見表2。需要計數的采用重復計數取平均值。

1.2? ?RAPD標記分析

采用改良CTAB法提取DNA。使用Eppendorf 公司PCR儀進行擴增，反應體系（20 μL）為1.0 ng/μL 模板DNA、0.45 mmol/L dNTP、1.3 μmol/L隨機引物、0.6 U Taq酶、2.0 mmol/L Mg2+。94 ℃預變性4 min，40個循環(huán)（94 ℃變性30 s，39 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s）;72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應。產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色拍照。從300條隨機引物中篩選出多態(tài)性高的引物做3次重復。

1.3? 數據處理

使用Genetics Statistics 3.0（2007SR11872）計算引物的Simpson多樣性指數和Shannon多樣性指數，分析種質特異性指數。

群體結構分析：使用Structure軟件對96份芫荽種質的群體結構進行基于數學模型的類群劃分，并計算材料相應的Q。Q為該品種基因型變異來源于某亞群的概率。

關聯分析：利用TASSEL軟件（Edward Buckler，2007）的GLM（General linear model）程序，將各個體Q作為協(xié)變量，將19個性狀的表型數據分別對標記變異進行回歸分析。

2? 結果與分析

2.1? RAPD標記掃描分析

300條引物對具有代表性的48份芫荽資源進行PCR擴增，經過復篩，得到23條擴增性強、清晰度高、穩(wěn)定性好的引物，用此23條引物對96份芫荽種質進行RAPD擴增，共擴增53條帶，其中34條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為64.2%。每個引物檢測到的等位基因個數分布在2～10，平均為4.61，引物檢測的等位基因數越多，引物在資源鑒別中的作用就越大。芫荽基因組PCR擴增，不同引物在擴增總條帶數、多態(tài)性條帶數、條帶亮度等方面均表現出差異。

利用遺傳統(tǒng)計軟件Genetics Statistics3.0分析引物的多樣性指數（表3）。引物的Simpson多樣性指數介于0.098～0.505，平均多樣性指數為0.344，多樣性指數大于平均指數的引物有14條;引物的Shannon多樣性指數介于0.085～0.301，平均多樣性指數為0.221，多樣性指數大于平均指數的引物與Simpson多樣性指數中一致。等位基因數與多樣性指數這兩類大于平均數的指數中，共同出現的引物有4對，說明在一定情況下，引物檢測到的等位基因數越多，其多樣性指數越高，表明區(qū)分品種的能力越強。

用資源遺傳統(tǒng)計軟件Genetics Statistics 3.0分析得到種質的特異性指數（表4），可以看出，種質特異指數介于69.964～208.694，平均為104.29。84號種質的特異指數最高，77號種質特異指數最低。其中，大于平均特異性指數的種質編號有5、6、9、11、13、14、15、17、18、19、21、22、24、30、32、33、36、37、38、

44、45、52、54、60、64、65、67、68、71、76、79、81、83、84、

86、89、92。種質特異指數越高，表示該種質在檢測位點中含有特異等位基因數目越多，這可為種質資源鑒定提供參考。

2.2? 群體結構分析

群體結構指一個群體內亞群存在的情況。亞群的混合使整個群體的LD強度增強，導致虛假基因的多態(tài)性位點與性狀之間的相關性，從而提供假陽性結果。關聯分析前對群體結構進行分析和調節(jié)是必要的。通過Structure軟件對該群體結構進行基于數學模型的類群劃分，計算材料相應的Q分析，先設定群體數目（K）為4～15，并假定位點都是獨立的，進行10次隨機抽樣分析，以獲得穩(wěn)定可靠的結果，然后依據分析選取一個合適的K。經分析確定當K=14時得到最穩(wěn)定、最可信的分類，即判斷該資源群體可以分為14個亞群。

2.3? 與性狀相關聯RAPD分析

群體結構是造成關聯分析假陽性結果的主要原因，Buckler 等利用隨機標記估算的各個個體相應的Q作為協(xié)變量，對性狀的表型變異與標記變異進行回歸分析，消除參試材料的群體結構引起的偽關聯，從而找到與性狀QTL真正相關聯的標記及其等位變異。利用TASSEL軟件的GLM（General Linear Model）程序，以各個體Q作為協(xié)變量進行群體矯正，將19個性狀的表型數據分別對標記變異進行回歸分析，以此尋找影響芫荽性狀變異的主要變異位點（閾值選擇P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著）。結果見表5。

分析表明，53個RAPD標記中有17個標記與19個性狀中的15個性狀相關聯?？v向分析表5發(fā)現，與抽薹天數（DSE）相關聯的標記有1個（S31-750），該標記對此性狀的解釋率為0.042;與始花期（DSF）相關聯的標記有2個（S31-1500、S31-750），2個標記對該性狀的解釋率均為0.050;與終花期（DEF）相關聯的標記有2個（S31-1500、S31-750），2個標記對該性狀的解釋率均為0.050;與花期（FR）相關聯的標記有3個（S183-2200、S183-1700、S2003-1500），對該性狀的解釋率分別為0.065、0.065、0.055;與收獲天數（DH）相關聯的標記有2個（S31-1500、S31-750），對該性狀的解釋率均為0.049;與莖中花青素（ANST）相關聯的標記有2個（S507-1800、S507-1500），對該性狀解釋率均為0.064;與基生葉數（NBL）相關聯的標記有2個（S167-1500、S167-1100），對該性狀的解釋率均為0.048;與最長基生葉長（LLBL）相關聯的標記有2個（S31-1500、S31-750），對該性狀的解釋率均為0.056;與基生葉生長習性（HBL）相關聯的標記有4個（S24-1800、S24-1600、S1260-1300、S2003

-1900），對該性狀的解釋率分別為0.084、0.084、0.074、0.074;與株高（PH）相關聯的標記有2個（S507-1800、S507-1500），對該性狀解釋率均為0.067;與植株生葉狀態(tài)（LP）相關聯的標記有2個（S167-1500、S167-1100），對該性狀的解釋率均為0.069;與分枝數（NB）相關聯的標記有2個（S1-2200、S1-700），對該性狀的解釋率均為0.053、;與果實形狀（SF）相關聯的標記有6個（S31-1500、S31-750、S1260-1300、S2003-1900、S2029-1000、S2029-700），對該性狀的解釋率分別為0.078、0.078、0.093、0.093、0.085、0.085;與千粒重（W1000F）相關聯的標記有2個（S1260-1300、S2003-1900），對該性狀的解釋率均為0.104;與果實裂果趨勢（TSF）相關聯的標記有2個（S1260-1300、S2003-1900）對該性狀的解釋率均為0.096。

橫向分析（表5）可以發(fā)現，同一標記與多個性狀相關聯的情況在分析中出現，如S31-1500標記與5個性狀有關聯（始花期、終花期、收獲天數、最長基生葉長、果實形狀）;S31-750標記與6個性狀關聯（抽薹天數、始花期、終花期、收獲天數、最長基生葉長、果實形狀）;S167-1500與S167-1100標記均與2個性狀關聯（基生葉數、植株生葉狀態(tài)）;S507-1800與S507-1500標記均與（莖中花青素、株高）有關聯;S1260-1300標記與4個性狀關聯（基生葉生長習性、果實形狀、千粒重、果實裂果趨勢）;S2003-1900標記同樣與基生葉生長習性、果實形狀、千粒重、果實裂果趨勢4個性狀關聯。

其中，S167-1100與植株生葉狀態(tài)（LP）的關聯，S1260-1300、S2003-1900與果實裂果趨勢（TSF）的關聯，S1260-1300、S2003-1900與千粒重（W1000F）的關聯，S1260-1300、S2003-1900、S2029-1000與果實形狀（SF）的關聯，S24-1800與基生葉生長習性（HBL）的關聯是極顯著水平的關聯。

從表5還可看出，多數同一引物的兩個標記位點與某一性狀關聯，其表型變異解釋率相同，如S31-1500、S31-750標記與始花期相關聯，解釋率均為0.050;S507-1800、S507-1500與莖中花青素解釋率均為0.064。

利用關聯分析結果，可根據育種目標要求進行育種設計，將不同標記位點上的優(yōu)良等位變異聚合于一體，改良單性狀或綜合性狀。

3? 小結與討論

群體結構的不均一性影響多態(tài)性位點的連鎖不平衡狀態(tài)，進而影響關聯分析的準確性。本研究通過多位點基因型數據的聚類來分析群體結構，計算每一芫荽種質歸入各亞群的概率（Q），并以每一芫荽種質的Q作為協(xié)變量進行關聯分析，矯正亞群混合造成的偽關聯。在資料處理過程中，對不包括Q協(xié)變量與包括Q協(xié)變量的關聯分析結果進行比較，發(fā)現增加Q協(xié)變量后檢出的關聯位點明顯少于不包括Q協(xié)變量所檢出的關聯位點，且在關聯位點的表型變異解釋上二者也有明顯的區(qū)別。由此可見，將Q作為協(xié)變量納入計算，在一定程度上規(guī)避了亞群混合造成的偽關聯。

種質資源是育種的基礎，遺傳基礎狹窄是制約優(yōu)良品種選育的主要因素之一。因此分析資源的遺傳多樣性，比較相互間親緣關系的遠近，對于育種工作的開展具有重要的指導意義。形態(tài)學分析與分子標記分析表明本研究收集的資源遺傳多樣性較好。

形態(tài)學與分子標記聚類結果均表現出分類與來源地不具有一定的相關性，說明資源間親緣關系與來源地之間關系不密切，可能與種質的交換和廣泛的遺傳變異有關。形態(tài)學標記是對各植物學和生物學性狀進行鑒定并分類，揭示的是芫荽的外部表現，而分子標記揭示的是芫荽堿基序列上的差異，從遺傳物質上揭示芫荽的遺傳多樣性。關聯分析也稱關聯作圖，已應用到許多植物上，如擬南芥、小麥、玉米、大麥、大豆等[21]。本研究利用TASSEL軟件對調查的表型性狀和分子標記進行關聯分析，分析發(fā)現19個性狀中有15個性狀與標記相關，與15個性狀相關聯的標記有17個。同時也發(fā)現，存在同一個性狀與多個位點相關聯，也存在同一標記與多個性狀相關聯。RAPD標記重復性差，試驗標記數量有限，在連續(xù)兩年的重復試驗中得到的標記較少。本研究初步分析了芫荽群體基因組狀況及其與性狀的關聯，在此基礎上將作擴展與深入研究。

參考文獻：

[1] LARIBI B，KOUKI K，MHAMDI M，et al.Coriander （Coriandrum sativum L.） and its bioactive constituents[J].Fitoterapia，2015，103：9-26.

[2] ADAMS M，SCHNEIDER S V，KLUGE M，et al.Epilepsy in the renaissance：A survey of remedies from 16th and 17th century German herbals[J].Journal of ethnopharmacology，2012，143（1）：1-13.

[3] AILINGER R L，MALLOY S，ZAMORA L，et al.Herbal remedies in a Nicaraguan barrio[J].Journal of transcultural nursing，2004， 15（4）：278-282.

[4] HASHEM DABAGHIAN F，KAMALINEJAD M，SHOJAII A，et al. Review of antidiabetic plants in Iranian traditional medicine and their efficacy[J].Journal of medicinal plants，2012，11：1-11.

[5] EFRAIM L，ZOHAR A.Fossils of practical medical knowledge from medieval Cairo[J].Journal of ethnopharmacology，2008，119（1）： 24-40.

[6] MARC E B，NELLY A，ANNICK D，et al. Plants used as remedies antirheumatic and antineur? algic in the traditional medicine of Lebanon[J].Journal of ethnopharmacology，2008，120（3）：315-334.

[7] SAKINA M，NASSER M A S，AKASH T，et al.Use of ethnomedicinal plants by the people living around Indus River[J].Evidence-based complementary and alternative medicine，2014， 2014：1-14.

[8] PADALIA K，BARGALI K，BARGALI S S.How does traditional home-gardens support ethnomedicinal values in Kumaun Himalayan Bhabhar belt， India？[J]African Journal of traditional， complementary，and alternative medicines，2015，12（6）：100-112.

[9] PIERONI A，GRAY C.Herbal and food folk medicines of the Russlanddeutschen living in Kunzelsau/Talacker，South-Western Germany[J].Phytotherapy research，2008，22（7）：889-901.

[10] WITT C M，BERLING N E J，RINPOCHE，et al. Evaluation of medicinal plants as part of Tibetan medicine prospective observational study in Sikkim and Nepal[J].Journal of alternative and complementary medicine，2009，15（1）：59-65.

[11] 徐? 悅，單承鶯，馬世宏，等.芫荽的研究進展與開發(fā)展望[J].中國野生植物資源，2017，36（1）：40-44.

[12] 郭紅轉，陸占國，李? 健.芫荽的研究開發(fā)現狀[J].食品研究與開發(fā)，2005，26（2）：104-106.

[13] 黃三文，王曉武，張寶璽，等.蔬菜作物分子標記研究進展與我國的發(fā)展策略[J].中國蔬菜，1999（1）：50-53.

[14] FLINT-GARCIA S A，THORNSBERRY J M，Buckler I V，et al. Structure of linkage disequilibrium in plants[J].Annual review of plant biology，2003，54：357-374.

[15] ZONDERVAN K T，CARDON L R.The complex interplay among factors that influence allelic association[J].Nature reviews genetics，2004，5（2）：89-100.

[16] GUPTA P K，RUSTGI S，KULWAL PL.Linkage disequilibrium and association studies in higher plants：present statusand future prospects[J].Plant molecular biology，2005，57（4）：461.

[17] LPEZ P A，WIDRLECHNER MP，SIMON P W，et al. Assessing phenotypic， biochemical， and molecular diversity in coriander （Coriandrum sativum L.） germplasm[J].Genet Resour Crop Evol 2008，55：247-275.

[18] 李小梅，張立微，張景濤.芫荽遺傳多樣性RAPD分析[J].北方園藝，2014，15：97-100.

[19] 李小梅，杜? 潔，張立微，等.芫荽種質資源形態(tài)標記遺傳多樣性分析[J].北方園藝，2015，13：26-30.

[20] DIEDERICHSEN A. Coriander.Promoting the conservation and use of underutilized and neglected crops.3[M].Rome：International plant genetic resources institute，1996.

[21] 韓俊杰，王昊龍，李衛(wèi)華.關聯分析及其在不同分子標記中的應用綜述[J].江蘇農業(yè)科學，2016，44（2）：13-17.