解淀粉芽孢桿菌AF1對雛雞益生性能和腸道菌群的影響

楊艷紅，余 瑛，胡永強，唐 夢

(重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054)

芽孢桿菌屬是一類在自然界分布廣泛的、非常安全的、具有抑菌和調(diào)節(jié)免疫功能的重要微生物[1]，作為益生菌的一種，其因具有抗逆性強、營養(yǎng)需求低、復(fù)活率高、繁殖能力強等特有的生物特性而備受關(guān)注。

研究表明：芽孢桿菌益生菌胞外不僅能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，抑制腸道病原菌生長，還能產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶等消化酶促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，因而能有效調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡且不會導(dǎo)致病原菌的耐藥性[2,3]。本文分離到1株芽孢桿菌AF1，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌[4]。初步研究發(fā)現(xiàn)，該菌株不僅能產(chǎn)生高活性酸性淀粉酶[4]和蛋白酶，還能產(chǎn)生抑制大腸桿菌、金葡菌、耐藥大腸桿菌和耐藥金葡菌等的抑菌活性物質(zhì)[5]。通過研究AF1對pH、豬膽鹽、人工腸液以及人工胃液的耐受性，發(fā)現(xiàn)其在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)均可生長，并且對豬膽鹽、人工胃液和人工腸液表現(xiàn)出很強的耐受能力[6]。本文旨研究AF1對雛雞的安全、生長性能以及其對雛雞腸道菌群的影響，為AF1應(yīng)用于畜牧業(yè)提供一定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

AF1，本實驗室分離。

優(yōu)菌肽(含有乳酸菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母等十多種益生菌，用于調(diào)節(jié)畜禽腸胃的活菌劑)，購自安徽申慧農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

AF1生長培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，蔗糖3%，蛋白胨2.5%，尿素0.33%，NaCl 1%， pH 7.0。

伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基(ZMB)：購自杭州微生物試劑有限公司。

SS瓊脂培養(yǎng)基：購自杭州百思生物技術(shù)有限公司。

Takara Minibest Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver3.0(Code No.9763)購自Takara(日本)。

RAPD PCR(含銀染，含40個10bp隨機引物)試劑盒(BTN101003)購自北京百奧萊博。

1.3 試驗動物

1月齡體重相近的健康脫瘟土雞苗120羽。

1.4 試驗方法

選取120只健康脫瘟土雞苗，隨機分成3組，每組40只(公母各20只)。第1組為空白對照組，飼喂基礎(chǔ)日糧；第2組為AF1益生菌組，飼喂基礎(chǔ)日糧+AF1菌(含菌量：2.0×107cfu·g-1)；第3組為優(yōu)菌肽組，飼喂基礎(chǔ)日糧+優(yōu)菌肽(含菌量：2.0×107cfu·g-1)。每天飼喂3次，保證足夠的飼料，常規(guī)飼養(yǎng)40 d。采用玉米-基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平參考我國現(xiàn)行肉用仔雞配合飼料標準GB/T 5616—2008。

1.5 安全性指標測定

每天觀察記錄雛雞的精神、食欲、行為、腹瀉情況和死亡率。試驗組停止喂加菌飼料3 d后，試驗結(jié)束，從各組隨機選取3只進行剖殺，檢查記錄臟器，尤其是消化道病變情況。

1.6 生產(chǎn)性能測定

試驗期間每天按試驗組分別記錄飼料剩、給料量。試驗開始時稱取各組雛雞質(zhì)量，作為始重，實驗結(jié)束后稱取各組雞的空腹質(zhì)量，作為末重。最后計算平均日采食量(ADFI)、日增體質(zhì)量(ADG)和料肉比(F/G)。

1.7 腸道病原菌測定

試驗組停止喂加菌飼料3 d后，試驗結(jié)束，從各組隨機選取3只雞進行剖殺，用剪刀縱向剪開盲腸，用無菌生理鹽水沖去附在腸內(nèi)壁上的食糜，然后刮取適量盲腸內(nèi)壁物于定量無菌生理鹽水中進行10倍梯度稀釋，最后把不同稀釋度樣品分別涂布于伊紅美藍瓊脂(ZMB)和SS瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，計算獲得每克樣品所含活菌數(shù)(結(jié)果以對數(shù)均值log10cfu/g內(nèi)容物表示)。

1.8 AF1對雛雞盲腸中微生物菌群的影響

盲腸取樣與菌增殖培養(yǎng)：AF1益生菌組停止飼喂加菌飼料3 d后，試驗結(jié)束，從AF1益生菌組和空白對照組分別隨機選取3只雞進行剖殺，用剪刀縱向剪開盲腸，用無菌生理鹽水沖去附在腸內(nèi)壁上的食糜，分別刮取適量盲腸內(nèi)壁物于AF1生長培養(yǎng)基中37 ℃，200 r/min培養(yǎng)20 h，然后12 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，收集菌體，作為每只雞的腸道菌群樣品，放置-80 ℃?zhèn)溆?。另接種純菌株AF1于生長培養(yǎng)基中37 ℃，200 r/min培養(yǎng)20 h，然后12 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，收集菌體放置-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

DNA提?。悍謩e取上述收集的菌體，嚴格按照Takara Minibest Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver3.0(Code No.9763)操作說明進行操作，獲得各樣品的總的DNA，放置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

AF1特異性引物篩選：從上述提取的DNA中隨機選取空白對照組1只雞的腸道菌群DNA以及純菌株AF1的DNA為模板，RAPD體系及反應(yīng)程序嚴格按照RAPD PCR(含銀染)試劑盒(BTN101003，北京百奧萊博)的說明，選取40條10 kb隨機引物(如表1)，分別進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物采用5% PAGE凝膠電泳，然后分析電泳圖篩選出AF1菌株的特異性引物。

表1 RAPD 引物序列

特異性引物PCR擴增：分別以上述所有樣品的DNA為模板，把上述篩選的AF1菌株的每個特異性引物為引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物采用5% PAGE凝膠電泳，分析統(tǒng)計AF1益生菌組雞腸道菌的擴增產(chǎn)物與AF1單菌株擴增產(chǎn)物的相似度來確定AF1菌在雞腸道中的定植情況。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2007 進行試驗數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，并采用LSD法進行組間多重比較，試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 AF1對土雞的安全性能的影響

通過觀察記錄試驗組與對照組飼養(yǎng)的雞的精神狀況、食欲、腹瀉情況、死亡情況以及解剖臟器病變情況來評估AF1菌株對雞的安全性能。由表2可知：AF1益生菌組的雞明顯比空白對照組和優(yōu)菌肽組的雞活躍，并且飼喂40 d后，AF1益生菌組沒有腹瀉雞和死亡的雞，存活率為100%，而空白組和優(yōu)菌肽組均出現(xiàn)腹瀉和死亡的雞。從平均日采食量可知：3組雞的食欲差異不顯著(P>0.05)。通過解剖臟器觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組和優(yōu)菌肽組各有1只雞的小腸出現(xiàn)紅色斑點且盲腸偏小，而AF1益生菌組雞的脾臟和胸腺偏大，其他器官正常，說明飼喂AF1菌以后，雞的免疫力增強，生病率減少，存活率提高。

2.2 AF1對土雞生長性能的影響

平均日采食量、日增體質(zhì)量和料肉比等生長性能方面的指標是飼料利用率、經(jīng)濟性和生物添加劑效果顯著與否的最直觀的表現(xiàn)。由表3 可知：對于平均日采食量，與空白對照組相比，AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組均沒有顯著差異(P>0.05)。對于平均日增體質(zhì)量，AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組顯著高于空白對照組(P<0.05)，而它們兩組之間差異不顯著(P>0.05)。對于料肉比，空白對照組顯著高于AF1益生菌組和優(yōu)肽組(P<0.05)，而AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組之間無顯著差異(P>0.05)。由此可見，AF1益生菌和購買的優(yōu)菌肽在飼喂土雞時可顯著提高飼料轉(zhuǎn)化率，降低飼料成本。

表2 AF1對土雞的健康狀況影響

指標空白對照組AF1益生菌組 優(yōu)菌肽組精神狀態(tài)++++食欲(平均日采食量)(ADFI,g·d-1)51.55±0.56a50.12±0.39a50.07±0.42a腹瀉數(shù)4無3死亡數(shù)3無2存活率/%92.510095解剖臟器觀察 1只小腸有紅色斑點,盲腸偏小,其他器官正常2只脾臟和胸腺較大,其他器官正常 1只小腸有紅色斑點,盲腸偏小,其他器官正常

注：“+”表示“一般”；“ ++”表示“較好”；數(shù)字右上側(cè)不同字母為差異顯著(P<0.05)；相同字母為差異不顯著(P>0.05)。

表3 AF1對土雞的生長性能的影響

注：數(shù)字右上側(cè)不同字母為差異顯著(P<0.05)，相同字母為差異不顯著(P>0.05)。

2.3 AF1對土雞腸道病原菌的影響

由表4可知：飼喂40 d后，AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組的大腸桿菌數(shù)明顯比空白對照組少，并且差異極顯著(P<0.01)。同時，在AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組的盲腸內(nèi)未檢出沙門氏菌，而空白對照組卻明顯檢出沙門氏菌?？梢?，AF1益生菌和優(yōu)菌肽都可以抑制腸道大腸桿菌和沙門氏菌的生長，尤其是對沙門氏菌效果更明顯，從而可以減少雞的腸道疾病發(fā)生。

表4 AF1對土雞腸道病原菌的影響

注：數(shù)字右上側(cè)不同大寫字母為差異極顯著(P<0.01)，相同大寫字母為差異不顯著(P>0.05)

2.4 AF1特異性引物篩選及PCR擴增

從40個10 bp隨機引物中篩選出空白對照組雞腸道菌群擴增條帶與純菌株AF1條帶相同率小于50%或者沒有相同條帶的引物6個即A3、A5、B1、B6、B7和B10，又從中挑選出3個重復(fù)性好、條帶清晰的引物為AF1的特異性引物即A3、A5和B6。然后用這3個引物，分別用所有AF1益生菌組腸道菌群、空白對照組腸道菌群和純菌株AF1的基因組DNA為模板進行PCR擴增，結(jié)果見圖1～3。

1-純菌株AF1；2,3,4-AF1益生菌組雞1,2,3；5,6,7-空白對照組雞1,2,3

1-純菌株AF1；2,3,4-AF1益生菌組雞1,2,3；5,6,7-空白對照組雞1,2,3

1-純菌株AF1；2,3,4-AF1益生菌組雞1,2,3；5,6,7-空白對照組雞1,2,3

按照PAGE凝膠電泳圖同一位置上DNA條帶的有無進行統(tǒng)計，有帶(包括弱帶)記為“1”，無帶記為“0”，計算各組實驗中每只雞腸道菌群的各個引物PCR擴增產(chǎn)物條帶與純菌株AF1擴增產(chǎn)物相同的條帶的百分比P，即P=(NXY/NX)×100%，NXY是純菌株AF1和雞腸道菌群的PCR擴增產(chǎn)物中分子量大小相同的DNA條帶數(shù)，NX是純菌株AF1 的PCR擴增產(chǎn)物的DNA條帶總數(shù)。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：對于引物A3(如圖1和表5)，純菌株AF1總共獲得20條擴增條帶，AF1益生菌組3只雞分別有13、15和14個條帶與純菌株AF1相同，平均有70±5.0%的條帶與純菌株AF1相同，并且它們之間的相似度平均達到了90%以上，而空白組3只雞之間的條帶完全相同，它們的條帶僅有6個條帶與純菌株AF1相同，平均只有30.0±0.0%的條帶與純菌株AF1相同。對于引物A5(如圖2和表6)，純菌株AF1總共獲得25條擴增條帶，AF1益生菌組3只雞分別有15、16和16個條帶與純菌株AF1相同，平均有63±2.3%的條帶與純菌株AF1相同，而空白組3只雞中除了第3只雞有少許條帶外，其余2只雞沒有擴增出任何條帶。對于引物B6(如圖3和表7)，純菌株AF1總共獲得14條擴增條帶，AF1益生菌組3只雞分別有7、11和10個條帶與純菌株AF1相同，平均有75.0±5.1%的條帶與純菌株AF1相同，而空白組3只雞都沒有擴增出任何條帶。

表5 引物A3擴增條帶比較

表6 引物A5擴增條帶比較

表7 引物B6擴增條帶比較

綜上，從3條特異性引物的PCR擴增電泳圖譜都可以看出，AF1益生菌組的3只雞的條帶相似度都達到了90%以上，空白對照組的3只雞的帶譜也幾乎完全相同，并且2組之間的條帶存在極顯著差異。由此推斷，AF1飼喂以后，對雞的腸道菌群有極顯著的影響，并且飼喂AF1后的3只雞，用不同的特異性引物擴增后，其條帶與純菌株AF1的擴增條帶有60%以上相同，提示經(jīng)飼喂AF1菌以后，AF1菌株可能在雞的盲腸內(nèi)定植，需進一步做實驗進行驗證。

3 討論

解淀粉芽孢桿菌是芽孢桿菌屬中與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌，在自然界中分布廣泛，易分離培養(yǎng)，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境；其代謝產(chǎn)物較為豐富，具有廣譜抗菌活性和較強的抗逆能力[7-8]。目前，對解淀粉芽孢桿菌研究主要集中在生防領(lǐng)域，用于植物病原真菌和細菌的防治[9-10]。

解淀粉芽孢桿菌除了可以產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等多種胞酶外，還可以產(chǎn)生大量穩(wěn)定性較強的低分子抗生素、抗菌多肽、抗菌脂肽和抗菌蛋白類抑菌物質(zhì)[8]。因此，把解淀粉芽孢桿菌用于動物飼養(yǎng)，可以有多重功效，不僅可以利用多種酶系促進飼料的消化和吸收，還可以利用抗菌物質(zhì)抑制腸道病原菌生長，同時利用其好氧性消化掉腸道氧氣，為腸道的大部分厭氧益生菌提供有益的厭氧環(huán)境，促進腸道菌群的平衡和腸道健康。近年來，國內(nèi)外對其益生性能進行了大量研究，在魚、母豬、肉雞的飼養(yǎng)中取得了不錯的效果[8,11-14]。但是，解淀粉芽孢桿菌同樣由于其來源的不同，飼喂效果差異很大，有些甚至沒有任何效果[7,15]，再加上目前解淀粉芽孢桿菌作為益生菌飼喂動物的研究還處于初始階段，進一步篩選和研究新的解淀粉芽孢桿菌作為動物益生菌是非常有必要的。

本文用于研究的解淀粉芽孢桿菌AF1不僅能產(chǎn)生高活性酸性淀粉酶[4]和蛋白酶，還能產(chǎn)生抑制大腸桿菌、金葡菌、耐藥大腸桿菌和耐藥金葡菌等的抑菌活性物質(zhì)[5]。并且AF1對酸堿、豬膽鹽、人工胃液和人工腸液表現(xiàn)出很強的耐受能力[6]。本文研究表明：解淀粉芽孢桿菌AF1飼喂1月齡脫瘟土雞苗后，相對于空白組和優(yōu)菌肽組，AF1益生菌組無一只腹瀉雞，存活率為100%。AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組平均日增重顯著高于空白對照組(P<0.05)，而料重比顯著低于空白對照組(P<0.05)。AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組的盲腸內(nèi)大腸桿菌數(shù)明顯比空白對照組少(P<0.01)，且未檢出沙門氏菌。采用RAPD技術(shù)篩選AF1菌株的特異性引物并進行PCR擴增，AF1益生菌組停止飼喂加菌飼料 3 d后，3只雞腸道菌群的DNA條帶相似度達到90%以上，與純菌株AF1的條帶有60%以上相同，空白對照組3只雞的帶譜也幾乎完全相同，但與純菌株AF1的條帶存在極顯著差異。由此可見，單菌株解淀粉芽孢桿菌AF1不僅能定植于雞腸道內(nèi)影響腸道菌群，抑制病原菌生長，減少疾病發(fā)生，提高雞存活率，還能顯著提高雞飼料轉(zhuǎn)化率，促進雞的生長。近年來，隨著進一步深入研究，其作為食品防腐劑、飼料添加劑和抗生素替代益生菌的應(yīng)用開發(fā)也不斷受到重視[11,16-20]。作為益生菌直接添加到動物飼料中，除了無毒無害以外，必須還要具有以下功能：能定植動物腸道，平衡腸道菌群，促進腸道健康，增強機體免疫力，提高飼料消化率和吸收率，從而促進動物生長，降低飼喂成本[11]。最常見的益生菌主要包括乳酸菌屬、酵母菌屬和產(chǎn)孢子的芽孢桿菌屬等[21]。但是由于來源和種屬不同，各種益生菌的應(yīng)用研究效果存在很大的差異，目前大部分益生菌產(chǎn)品都是以多種菌混合的復(fù)合制劑。而根據(jù)上述研究，單菌株解淀粉芽孢桿菌AF1作為益生菌飼喂雞，不僅可以定植雞的腸道，而且其飼喂效果達到市場購買的復(fù)合益生菌產(chǎn)品優(yōu)菌肽，甚至某些指標更優(yōu)于優(yōu)菌肽。

可見，單菌株解淀粉芽孢桿菌AF1具有多功能的益生效果，作為動物益生菌的開發(fā)，它不僅可以解決目前市場復(fù)合益生菌制劑在加工、運輸及保存過程中容易失活以及在動物腸道中不能有效定植等問題[22-23]，并且作為單菌株制劑進行生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝方法更簡單、生產(chǎn)成本更低。

4 結(jié)論

1) 解淀粉芽孢桿菌AF1飼喂1月齡脫瘟土雞苗40 d，雞的存活率達到100%，比飼喂優(yōu)菌肽組的雞更好。

2) 通過對比AF1益生菌組、優(yōu)菌肽組和空白對照組3組雞的平均日采食量、日增體質(zhì)量和料肉比，雖然3組雞的平均日采食量之間差異不明顯，但是AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組平均的日增體質(zhì)量都顯著高于空白對照組(P<0.05)，而料肉比顯著低于空白對照組(P<0.05)，可見解淀粉芽孢桿菌AF1和優(yōu)菌肽一樣能顯著提高雞飼料轉(zhuǎn)化率，降低飼料成本。

3) 刮取雞盲腸內(nèi)壁物檢測病原菌，AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組的盲腸內(nèi)大腸桿菌數(shù)明顯比空白對照組少(P<0.01)，且未檢出沙門氏菌，證明解淀粉芽孢桿菌AF1和優(yōu)菌肽一樣能抑制病原菌生長，減少疾病發(fā)生。

4) 采用RAPD技術(shù)篩選AF1菌株的特異性引物并進行PCR擴增，AF1益生菌組3只雞腸道菌群的DNA條帶相似度達到90%以上，與純菌株AF1的條帶有60%以上相同，空白對照組3只雞的帶譜也幾乎完全相同，且2組之間的條帶存在極顯著差異，表明AF1菌在飼喂土雞時很有可能定植在雞腸道內(nèi)影響腸道菌群，發(fā)揮益生作用。