穩(wěn)定性篩選莪術(shù)油亞微乳及體外溶血性評(píng)價(jià)

楊金蘭，陳忠敏，馮麗霖，王富平

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 重慶 400054)

中藥注射劑是中藥現(xiàn)代化的重要產(chǎn)物，也是傳統(tǒng)醫(yī)藥理論與現(xiàn)代生產(chǎn)工藝相結(jié)合的產(chǎn)物[1]。與其他傳統(tǒng)藥物劑型相比，注射劑的生物利用度更高、起效更快、療效較好，特別是在一些危重癥患者和不能口服給藥患者的臨床治療中，發(fā)揮了重要的作用[2]。盡管國家對(duì)于中藥注射劑的提取技術(shù)沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，同一產(chǎn)品在不同提取方式、不同批次、不同廠家獲得指紋圖譜相似性存在差異，但目前依然在臨床中應(yīng)用廣泛，在許多疾病的治療中發(fā)揮著重要的作用。中藥注射劑常使用增溶劑提高中藥有效成分的穩(wěn)定性、溶解性，降低刺激性等，但其臨床應(yīng)用依然有限。如莪術(shù)油注射液，盡管莪術(shù)油具有抗腫瘤[3]、病原體、抗血栓、抗?jié)儭⒖乖缭械榷喾N作用[4]，但由于其處方中主要通過吐溫-80增溶[5]，吐溫-80會(huì)引起家兔紅細(xì)胞溶血和形變，且溶血率呈濃度和時(shí)間相關(guān)性增加[6]，同時(shí)有較大的刺激和過敏作用，其使用濃度和應(yīng)用范圍受限[7]，導(dǎo)致莪術(shù)油注射液目前只被應(yīng)用于消炎、抗病毒領(lǐng)域[8]。

為解決此問題，大量研究集中在用其他藥用輔料替代吐溫-80，如林海東在制備莪術(shù)油亞微乳注射液中，采用大豆油、精制蛋黃磷脂、油酸、伯洛沙姆(F68)為輔料，可室溫下放置6個(gè)月基本穩(wěn)定，以期避免原注射劑輔料所引起的副作用[9]。祁鳴[10]用大豆油、蛋黃卵磷脂、F68、油酸、維E、甘油為輔料，穩(wěn)定常數(shù)Ke平均最低為58.2%，加速試驗(yàn)和長(zhǎng)期留樣試驗(yàn)結(jié)果顯示穩(wěn)定性良好，至少可儲(chǔ)存12個(gè)月，體外無明顯溶血作用，對(duì)兔耳靜脈血管無明顯不良刺激。黃尊動(dòng)[11]用大豆油、中鏈油、F68、維E、甘油為輔料，30 ℃和40 ℃加速實(shí)驗(yàn)6個(gè)月后，莪術(shù)油亞微乳外觀性狀不發(fā)生變化，主藥含量不下降，各項(xiàng)參數(shù)不發(fā)生變化，基本無局部刺激性、溶血性。由于大部分莪術(shù)油乳劑中常存在大豆油、甘油，在長(zhǎng)期放置時(shí)游離脂肪酸和過氧化脂質(zhì)含量會(huì)升高，導(dǎo)致保質(zhì)期縮短，副作用增加[12]，為了防止脂質(zhì)氧化，通常需加入抗氧劑，但增加了安全不確定性。另外，甘油會(huì)被氧化成丙烯醛而具有刺激性。為此，本研究排除大豆油、甘油，采用泊洛沙姆188(Poloxamer 188，F(xiàn)68)、海藻酸鈉(sodium alginate，SA)和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)。其中，F(xiàn)68作為一種水包油乳化劑是目前用于靜脈乳劑極少數(shù)合成乳化劑之一，用F68能夠制備出粒徑小、穩(wěn)定、吸收率高的乳劑。SA可用作助乳化劑，具有藥物制劑輔料所需的穩(wěn)定性、溶解性、黏性和安全性。PEG可用作穩(wěn)定劑，能提高難溶藥物的溶解度及加強(qiáng)藥物在水中的穩(wěn)定性，將其用作修飾乳劑穩(wěn)定性，用3種生物相容性良好的材料替代Tween-80對(duì)莪術(shù)油的增溶作用和穩(wěn)定作用，對(duì)其市售型的莪術(shù)油亞微乳進(jìn)行改性，制備一種高穩(wěn)定性、低溶血風(fēng)險(xiǎn)莪術(shù)油亞微乳，為擴(kuò)大莪術(shù)油亞微乳注射液臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 儀器與藥品試劑

1.1 儀器

D3024R臺(tái)式高速微量離心機(jī)(北京科博賽爾科技有限公司)、AR1530精密電子天平(島津企業(yè)管理(中國)有限公司)、SHX150ⅡI生化培養(yǎng)箱(上海樹立儀器儀表有限公司)、PR-310酶標(biāo)分析儀( 深圳市普康電子有限公司)、Bettersize2000智能激光粒度儀(中國遼寧省丹東市百特)、JRJ300-S型實(shí)驗(yàn)室剪切乳化機(jī)(上海索映儀器設(shè)備有限公司)、OS20-PRO機(jī)械攪拌器(北京科博賽爾科技有限公司)、752N紫外可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)、TU-1901紫外-可見分光光度儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.2 藥品與試劑

莪術(shù)油(吉安市青原區(qū)綠源天然香料油提煉廠)、海藻酸鈉、香蘭素(香草醛)、濃硫酸、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯(簡(jiǎn)稱聚山梨酯-80、吐溫-80)、聚乙二醇400(PEG)(成都市科龍化工試劑廠)、泊洛沙姆188(F68)(中國阿達(dá)馬斯試劑)為市售分析純，水為注射用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 亞微乳的制備

2.1.1莪術(shù)油亞微乳劑的制備

在攪拌條件下，將F68、Tween-80、SA、PEG依次分散于注射用水中，后將莪術(shù)油緩慢滴入進(jìn)行預(yù)溶，再進(jìn)行高速剪切乳化(8 000 r/min，1 h)，最后將莪術(shù)油亞微乳置于-20 ℃冷凍24 h，取出冷凍乳劑進(jìn)行溶化即得。

2.1.2離心穩(wěn)定常數(shù)(Ke)的計(jì)算

乳劑因在長(zhǎng)期靜置時(shí)穩(wěn)定性變化導(dǎo)致分層、絮凝、合并、破乳等。將乳劑在一定轉(zhuǎn)速下離心一段時(shí)間，可相當(dāng)于自然靜置較長(zhǎng)時(shí)間。因此，用離心分光法測(cè)定Ke是評(píng)價(jià)乳劑穩(wěn)定性常用的一種方法，Ke越小，制劑越穩(wěn)定。

取乳劑3 mL置5 mL離心試管中，4 000 r/min離心15 min后，精密量取試管底部樣品50 μL至10 mL量瓶中，用經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過的蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，以蒸餾水為空白，在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度(A)。同法精密量取未離心乳劑樣品50 μL至10 mL量瓶中，同法測(cè)定吸光度(A0)，按式(1)計(jì)算Ke(0

Ke=(A0-A)/A×100%

(1)

2.1.3正交試驗(yàn)處方優(yōu)化

以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，取對(duì)乳劑穩(wěn)定性影響較大的輔料含量(A)、SA占輔料含量(B)、乳化劑中F68與Tween-80的比例(C)、PEG添加量(D)作為正交設(shè)計(jì)因素，以Ke為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最優(yōu)處方。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素、水平安排見表1，用L25(55)正交表安排實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)安排

水平因素Aw(輔料)/%BSA占輔料的含量/%CF68:Tween-80DPEG/g10.50804∶10.0520.75703∶10.1031.00602∶10.2041.25501∶10.5051.50401∶21.00

根據(jù)表2中極差值(R)可知：各因素對(duì)亞微乳穩(wěn)定性影響主次順序是C、D、B、E、A，即乳化劑中F68與Tween-80的比例、PEG添加量、SA占輔料含量、輔料的含量的影響依次減弱。同時(shí)，通過分析正交設(shè)計(jì)表及綜合因素篩選得各因素最優(yōu)化組合為A2B2C5D5，最優(yōu)處方為輔料含量為0.75%，其中SA占輔料含量的70%，乳化劑中F68占輔料的10%，Tween-80占輔料的20%，PEG添加量為1 g。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

No.AB C D E Ke/%11111179.05212422266.2531333368.5741444417.0351555516.6462123437.0372234521.4782345135.4792451224.29102512357.52113135218.5112324136.85133352427.30143413579.06153524186.70164142524.73

No.AB C D E Ke/%174253130.93184314247.29194425344.92204531454.61215154331.40225215428.21235321522.25245432121.07255543279.76k149.5138.1458.2337.4150.64k235.1630.7451.4339.3747.22k343.6840.1836.8559.0741.85k440.5032.2732.7740.7832.84k536.5459.0526.1128.7532.83A2B2C5D5R14.3528.3032.1130.3217.81C>D>B>A

由于A2B2C5D5組合不在25次正交實(shí)驗(yàn)中，而A3B2C4D1在25組實(shí)驗(yàn)中穩(wěn)定性高,按此2組較優(yōu)處方，在固定工藝條件下制備亞微乳，平行6次，結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表

由表3可知：正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)所得的單因素最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案A2B2C5D5的穩(wěn)定性高于正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)組A2B3C4D1。綜合單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)處方為輔料含量0.75%，其中SA占輔料含量的70%，乳化劑中F68占輔料的10%，Tween-80占輔料的20%，即莪術(shù)油∶SA∶Tween-80∶F68∶PEG=10∶21 ∶6 ∶3 ∶10。其中，本處方莪術(shù)油亞微乳中Tween-80所加含量為0.15%，占所用輔料的20%。

2.2 亞微乳乳劑粒徑大小分布測(cè)定

將最優(yōu)處方制備的莪術(shù)油亞微乳用粒度分析儀測(cè)定其粒徑大小分布，對(duì)莪術(shù)油亞微乳粒徑大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，評(píng)價(jià)莪術(shù)油亞微乳粒徑的均一度。結(jié)果如圖1所示，莪術(shù)油亞微乳的粒徑范圍在0.136～0.509 μm，其平均粒徑大小為0.306 μm，97%的粒徑小于0.443 μm，面積平均徑D[3，2]=0.288 μm，D(4，3)=D50=0.306 μm，顯示D(3，2)和D(4，3)結(jié)果接近，樣品顆粒的形狀規(guī)則，呈圓球型，并且粒度分布集中。

2.3 亞微乳劑含量測(cè)定

按中國藥典2010年版二部采用紫外-可見分光光度法測(cè)定莪術(shù)油的含量[15]，再以乙醇與香草醛顯色反應(yīng)后為對(duì)照組，如圖2所示莪術(shù)油亞微乳、莪術(shù)油與香草醛顯色反應(yīng)后在442 nm處呈最大吸收峰，空白亞微乳在此無吸收峰，說明輔料在此波長(zhǎng)時(shí)對(duì)莪術(shù)油檢測(cè)無明顯干擾。

圖1 莪術(shù)油亞微乳粒徑分布

圖2 方法專屬性考察

配制95.3 μg/mL的莪術(shù)油乙醇溶液作為標(biāo)準(zhǔn)液，分別吸取1、0.8、0.6、0.4、0.2 mL于10 mL容量瓶中，同時(shí)用1 mL的無水乙醇為空白對(duì)照，用新配制的0.2%香草醛硫酸溶液定容，將定容好的溶液避光靜置2 h后在波長(zhǎng)為442 nm進(jìn)行分光光度法測(cè)定，記錄A值，在1.906～9.53 μg/mL莪術(shù)醇濃度范圍內(nèi)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：C=108.239 6A-5.712 1,R=0.999 8(其中A吸光度，C代表濃度)。

取亞微乳樣品制成供試品溶液進(jìn)行香草醛顯色，經(jīng)測(cè)定A442=0.255±0.004，代入標(biāo)準(zhǔn)方程得載藥量為2.188 9±0.043 g·L-1。

2.4 亞微乳劑穩(wěn)定性驗(yàn)證

2.4.1稀釋穩(wěn)定性

亞微乳劑在臨床上通常以5%的葡萄糖注射液和0.9%的NaCl生理鹽水稀釋，因此考察本品在二者中稀釋后的物理穩(wěn)定性。方法：將莪術(shù)油亞微乳劑樣品與5%葡萄糖注射液和0.9%的NaCl生理鹽水按l∶25分別配伍，室溫放置，于0、2、4、8、16和24 h后觀察外觀，測(cè)定其pH值及平均粒徑，結(jié)果如圖3、4所示，pH值無明顯變化，但在生理鹽水稀釋條件放置，乳劑粒徑變化顯著，說明用5%葡萄糖注射液稀釋所得乳劑穩(wěn)定性較好。

圖3 稀釋后pH值變化

圖4 稀釋后平均粒徑變化

2.4.2長(zhǎng)期穩(wěn)定性

在試驗(yàn)期間，分別于第3、6、9、12個(gè)月末取樣1次，對(duì)莪術(shù)油亞微乳的穩(wěn)定性常數(shù)、pH值、平均粒徑、藥物含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表4所示。在亞微乳外觀無分層漂油現(xiàn)象，為乳白色半透明色，與0月狀態(tài)比較無明顯差別，pH值、離心穩(wěn)定常數(shù)、藥物含量無明顯變化，穩(wěn)定性良好，有效期至少1年，從而驗(yàn)證高速離心法可代替加速實(shí)驗(yàn)完成乳劑穩(wěn)定性的檢測(cè)。

表4 長(zhǎng)期穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

時(shí)間外觀 Ke/%pH值平均粒徑/nm藥物含量/(g·L-1)RSD/%3月乳白色,半透明 5.197.153082.116月乳白色,半透明5.307.153102.089月乳白色,半透明5.557.163112.0512月乳白色,半透明5.607.183232.000.19

2.5 亞微乳體外溶血性評(píng)價(jià)

按照《中國藥典》2010年版2部附錄的紫外分光光度測(cè)定溶血率法對(duì)莪術(shù)油亞微乳進(jìn)行體外溶血評(píng)價(jià)。依照表5將生理鹽水/蒸餾水/莪術(shù)油亞微乳/市售型莪術(shù)油注射液于含2%的紅細(xì)胞混懸液的試管中，充分混勻后置37 ℃生化培養(yǎng)箱中。4 h后移至離心管，1 000 r/min離心5 min，取200 μL上清液與96孔板中，設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，用540 nm波長(zhǎng)測(cè)定各組樣品的OD值，計(jì)算平均值，根據(jù)計(jì)算結(jié)果按照公式(2)計(jì)算溶血率[16-17]。

溶血率(%)=(Dt-Dnc)/(Dnc-Dpc)×100%

(2)

其中：Dt為實(shí)驗(yàn)組莪術(shù)油亞微乳樣品的吸光值；Dnc為陰性對(duì)照組生理鹽水樣品的吸光值；Dpc為陽性對(duì)照組蒸餾水樣品的吸光值。

溶血性試驗(yàn)是常用的一種檢測(cè)注射劑安全性的最基本的方法，可考查到注射劑在血液中的溶血性。通過紫外分光光度測(cè)定的溶血率法結(jié)果如圖4顯示。莪術(shù)油亞微乳溶血率隨著濃度的增加而升高，在莪術(shù)油濃度達(dá)到0.024 g·L-1后，無明顯變化，維持在1.4%左右，最大為1.47%，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于安全閾值5%，符合國家標(biāo)準(zhǔn)[18]。而市售型莪術(shù)油注射液濃度大于0.024 g·L-1后溶血率出現(xiàn)劇增且超過5%，顯示市售型莪術(shù)油注射液在濃度較高時(shí)具有較大的溶血風(fēng)險(xiǎn)。

表5 溶血實(shí)驗(yàn)安排

圖5 溶血率隨濃度的變化

3 討論

亞微乳作為注射劑必須具有必要的物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，以確保產(chǎn)品在貯存期安全、有效，然而亞微乳又是屬于熱力學(xué)不穩(wěn)定的一種非均相分散體系，會(huì)受到乳化劑用量，乳化時(shí)間、溫度等影響，因穩(wěn)定性改變，而在儲(chǔ)存過程中出現(xiàn)分層、破乳、析油等現(xiàn)象，因此亞微乳的穩(wěn)定性考察是制備亞微乳的一個(gè)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性的測(cè)定選擇離心分光法，高速離心增加了乳滴之間的碰撞幾率，可以在短時(shí)間模擬乳劑長(zhǎng)時(shí)間存放過程中乳滴之間的碰撞、合并的結(jié)果，在一定程度上等同于長(zhǎng)期存儲(chǔ)，從而提高了實(shí)驗(yàn)效率。

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上通過正交試驗(yàn)篩選莪術(shù)油亞微乳制備最佳處方，制備出的亞微乳穩(wěn)定常數(shù)達(dá)到(5.42±0.47)%，且重復(fù)性高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于已有文獻(xiàn)報(bào)道的莪術(shù)油亞微乳(穩(wěn)定常數(shù)Ke平均最低為58.2%)[10]，表明在相同的儲(chǔ)存時(shí)間內(nèi)，本處方莪術(shù)油亞微乳穩(wěn)定性應(yīng)更高，原因可能是由于本研究選擇SA、F68作為乳化劑和助乳化劑，讓SA與F68兩者在油水界面產(chǎn)生了穩(wěn)定的乳化膜，且F68可在小油滴周圍形成空間立體屏障，增加液滴表面的親水性，避免莪術(shù)油吸附在乳滴表面。F68，SA可提高乳化效果，莪術(shù)油的油水表面張力得到緩解和釋放，提高了穩(wěn)定性[21]，同時(shí)PEG可增加溶液的穩(wěn)定性作用。

本處方制備的亞微乳粒徑分布在0.136～0.509 μm之間，屬于亞微米級(jí)，粒徑分布窄且連續(xù)，顆粒的形狀規(guī)則，呈圓球型。有研究表明：亞微乳劑的穩(wěn)定性與粒徑及其分布有關(guān)，粒徑越小、粒徑分布越窄，亞微乳劑越穩(wěn)定[22]。原因可能在于本處方選擇SA作為包裹莪術(shù)油的主要成分，SA插入乳化劑F68和吐溫-80的界面膜中，形成復(fù)合凝聚膜，提高了牢固性和柔順性，促進(jìn)曲率半徑很小的膜形成，增大了乳化劑的溶解度，降低界面張力，以致在高速乳化切割時(shí)，能形成粒徑大小均一乳劑。

本處方莪術(shù)油濃度為(2.188 9±0.43) g·L-1是市售型莪術(shù)油注射液(濃度為0.4 g·L-1)的5倍左右。盡管文獻(xiàn)[9]制備的納米乳劑粒徑為(76.5±10.1) nm，然而其濃度(1.76±0.09) g·L-1與本處方相近，低于祁鳴[10]的莪術(shù)油亞微乳濃度(10 g·L-1)，原因在于其輔料用量質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到13.83%，遠(yuǎn)高于本處方(0.75%)，輔料與莪術(shù)油的之比達(dá)到13.83∶1，而本處方此比例僅為3∶1，單位質(zhì)量輔料包裹莪術(shù)油量更大。

本處方用F68/SA/PEG替換80%的吐溫-80以后，在試驗(yàn)條件下顯著降低了由吐溫-80引起的溶血率急劇增加的風(fēng)險(xiǎn)，且即使繼續(xù)提高濃度，溶血風(fēng)險(xiǎn)也能控制在安全范圍內(nèi)。這可能與處方中的具有良好血液相容性的SA、F68、PEG對(duì)含量較少的吐溫-80起到了遮蔽作用有關(guān)，使其無法大量接觸紅細(xì)胞，還有可能在亞微乳乳滴表面被柔順而親水的PEG鏈覆蓋，提高亞微乳膜的親水性，降低表面自由能，使表面自由能降低到接近血管內(nèi)膜的表面自由能值，降低溶血風(fēng)險(xiǎn)。正常人體血管壁內(nèi)皮細(xì)胞的電位值為負(fù)，血液中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板等均帶負(fù)電荷，因此不易發(fā)生粘附[23]。SA在水溶液中可表現(xiàn)出聚陰離子行為，使亞微乳膜表面帶負(fù)電，從而減少血栓的形成，提高了血液相容性。

4 結(jié)束語

本研究篩選制備莪術(shù)油亞微乳的最佳處方具有較高的穩(wěn)定性和載藥量。本處方莪術(shù)油亞微乳從穩(wěn)定性、pH值、粒徑、溶血性方面符合國家中藥亞微乳注射液的標(biāo)準(zhǔn)要求，且在較高濃度下風(fēng)險(xiǎn)可控，為擴(kuò)大其在臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)，同時(shí)也可為其他中藥注射液的制備提供參考。