siGLUL經Akt/ERK信號通路抑制結腸癌細胞增殖及侵襲

吳 婧,唐曉婷,黃阿妹,房太勇

(福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院消化內科,福建 泉州 362000)

谷氨酰胺連接酶(Glutamate-ammonia ligase,GLUL)又稱谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)是在大多數物種中發(fā)現的一種ATP依賴性酶，能將谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，用于保持谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)以及氮代謝。GLUL是以ATP依賴性反應催化從谷氨酸和氨合成谷氨酰胺的酶。該蛋白質在氨和谷氨酸解毒、酸-堿穩(wěn)態(tài)、細胞信號傳導和細胞增殖中起作用。GLUL的表達與肝、腸上皮、視網膜和乳腺等細胞增殖相關。GLUL在肝細胞癌、膠質母細胞瘤、前列腺癌中上調，可能是一種新的診斷標志物。但該基因在結腸癌中的生物學作用目前尚未報道，尤其與Akt及ERK增殖及侵襲相關信號通路作用不明確。因此，本研究擬探索GLUL如何通過調節(jié)Akt/ERK信號途徑來促進結腸癌的發(fā)生發(fā)展。

1 對象及方法

1.1對象 結腸癌細胞SW480購于中國科學院上海細胞庫，在37 ℃和5 %的CO2培養(yǎng)條件下含，培養(yǎng)于10 %的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中每隔2～3 d傳代1次；設計針對GLUL基因的靶向干擾質粒，真核表達質粒pGenesil-1購于上海禾午生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1RT-PCR技術檢測GLUL基因轉錄水平 分別收獲對數期生長的SW480細胞、SW480-siGLUL細胞，取5×107個細胞加入1.5 mL離心管中，用槍頭吹吸含有1 mL的Trizol液至混勻，室溫放置5 min；每管中再加入0.2 mL氯仿，充分顛倒混勻，12 000 g轉速4 ℃ 離心5 min；每管再加入1 μL的RNase H，37 ℃反應20 min。GLUL基因引物上游序列5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3',下游序列5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3'；β-actin引物上游序列5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3',下游序列5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'。

1.2.2Western Blot檢測GLUL基因翻譯水平 分別收獲對數期生長的SW480細胞、SW480-siGLUL細胞，100 μL細胞裂解液加入106個細胞溶液，裂解20 min；12 000 g于4 ℃離心5 min；將上清移至離心管中，-70 ℃保存；蛋白濃度用Bradford法檢測，每組細胞取30 μg蛋白加入緩沖液混勻，沸水處理5 min，加入蛋白電泳槽；分別加入抗人GLUL單克隆抗體、抗鼠β-actin單克隆抗體，搖動孵育過夜，將抗體抗原充分融合，HRP標記羊抗兔IgG二抗稀釋于5 %脫脂牛奶中，緩慢搖動室溫孵育2 h，PBS漂洗10 min，共3次，ECL化學發(fā)光法顯色，觀測結果。

1.2.3MTT法檢測細胞生長曲線 將對照組SW480-Pu6和實驗組siGLUL-SW480細胞擴增充分后消化處理，接種于96孔板，細胞計數，接種后培養(yǎng)24 h，48 h，72 h行MTT檢測，將5 mg/mL的MTT試劑以每孔20 μL加入待測96孔板內，37 ℃培養(yǎng)4 h，注射器緩慢吸取上清液，并棄用，每孔加200 μL的DMSO搖床充分振蕩10 min，490 nm波長紫外分光光度計測定吸光度。

1.2.4細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將對照組SW480-Pu6和實驗組siGLUL-SW480細胞分別接種于六孔板中，等其細胞貼壁生長至95 %時，用同一槍頭分別劃痕，于劃痕后的0～24 h在顯微鏡下動態(tài)拍照，比較兩組細胞的遷移數量。

1.2.5裸鼠皮下移植瘤實驗 將4～6個月大小相近的雄性裸鼠16只隨機分成兩組，實驗組將siGLUL穩(wěn)轉SW480細胞注射裸鼠皮下；對照組用同樣方法將轉染空載體的SW480細胞注射裸鼠皮下。飼養(yǎng)裸鼠至瘤體肉眼可觀測到。用游標卡尺每隔4 d測量瘤體長徑、短徑，瘤體體積=[length(mm)×width(mm)2]/2，比較兩組裸鼠瘤體的生長情況。

2 結果

2.1GLUL在結腸癌細胞SW480中干擾效率 利用RT-PCR和Western Blot檢測構建穩(wěn)定GLUL的SW480細胞系干擾效率，結果顯示SW480-siGLUL細胞株1/2均有明顯干擾效果，其中siGLUL-1干擾效率最優(yōu)，以SW480-siGLUL-1細胞株進行后續(xù)研究，如圖1。

圖1 GLUL基因沉默的穩(wěn)轉細胞株在RNA和蛋白水平的驗證

2.2GLUL基因沉默抑制肝癌細胞的增殖、遷移功能 利用MTT法檢測實驗組SW480-siGLUL細胞和對照組SW480-Pu6細胞增長情況。結果顯示24 h，48 h，72 h，與對照組比較，siGLUL轉染SW480實驗組細胞增殖明顯減少(t24h=9.238,t48h=11.379,t72h=8.213，P<0.05)，如圖1-A；細胞劃痕試驗顯示實驗組siGLUL轉染SW480細胞遷移數量較對照組減低(t=7.921;P<0.05)，如圖1-B。

2.3SGLUL抑制AKT及ERK介導的細胞信號途徑 Western Blot檢測實驗組SW480-siGLUL細胞AKT的磷酸化水平明顯下降，如圖2，活性減弱；ERK1/2的磷酸化水平明顯下降，活性增強(ERK1/2的活性形式為去磷酸化)，如圖2。

圖2 GLUL基因表達沉默對AKT-和ERK-細胞信號通路的影響

2.4GLUL基因沉默抑制裸鼠皮下移植瘤的生長 實驗組SW480-siGLUL細胞及對照組SW480-Pu6細胞分別注射裸鼠皮下，誘導裸鼠皮下移植瘤產生(圖2-A)；與對照組相比，4 d、7 d、10 d、13 d及16 d實驗組移植siGLUL-SW480細胞裸鼠瘤體體積明顯減小(P<0.01)，如圖2-B。

3 討論

結腸癌是常見消化道腫瘤之一，但多數患者診斷時已屬晚期，且化療中易出現耐藥，導致結腸癌預后較差。因此，闡明結腸癌演進生物學機制并尋找有效診治靶點迫在眉睫。谷氨酰胺在腫瘤生長中扮演重要角色。但是，與葡萄糖代謝在腫瘤中的意義相比，谷氨酰胺代謝在腫瘤中的作用了解甚少。因此，本研究探討谷氨酰胺合成代謝關鍵酶(Glutamate-ammonia ligase,GLUL)對結腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制。本研究觀察GLUL基因表達沉默后對SW480細胞功能的影響，MTT及細胞劃痕試驗顯示干擾GLUL可抑制細胞增殖和遷移，證實GLUL對SW480細胞增殖和遷移具有促進作用。進一步動物體內實驗顯示GLUL對腫瘤形成的重要作用，與對照組相比，GLUL干擾后裸鼠皮下瘤的生長速度和瘤體大小均減少。由此可見，GLUL在結腸癌發(fā)展中扮演重要角色。關于GLUL介導結腸癌發(fā)展的具體機制需要進一步研究。

在諸多信號傳導途徑中AKT及ERK通路處于核心地位，在胃癌、結直腸癌、前列腺癌和卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要功能。AKT及ERK信號通路可以激活下游信號分子，也可與其它信號分子相互影響并引起級聯活化效應。因此，AKT及ERK信號在諸多信號傳導途徑中處于核心地位。那么，在結腸癌中GLUL是否也是介導AKT及ERK信號通路影響細胞增殖及侵襲等生物學表型目前仍不清楚。本研究顯示GLUL基因沉默的SW480細胞，p-AKT和p-ERK的表達也隨之下調，即AKT、ERK的活性均下降，因此初步認為GLUL也是通過AKT/ERK途徑來影響結腸癌生長。

綜上所述，GLUL促進SW480細胞的生長、增殖和遷移，從而促進人類結腸癌的發(fā)展過程，這一過程是通過影響Akt和ERK細胞信號轉導途徑來實現的。GLUL是谷氨酰胺合成的關鍵酶，后者是腫瘤細胞除Warburg效應外獲取能量來源的重要途徑，也是細胞內氮源重要的供體。GLUL有望成為結腸癌基因治療生物靶點。