不同營養(yǎng)條件對花臉香蘑菌絲生長的影響

陸歡　徐寧　王春暉　馮立國　鄧召利　夏義良

摘要：研究花臉香蘑（Lepista sordida）菌絲平板培養(yǎng)最佳碳源、氮源和無機鹽，得到優(yōu)化配方。以花臉香蘑菌絲生長速度為指標，通過平板培養(yǎng)研究9種碳源、8種氮源及6種無機鹽對花臉香蘑菌絲生長的影響，并用三元二次正交回歸試驗對花臉香蘑的培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化。結果表明，促進花臉香蘑菌絲生長的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為麩皮，最佳無機鹽為MgSO4，培養(yǎng)7 d后菌絲生長速率分別為2.29、1.88、1.64 mm/d;優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯20%、瓊脂2%、蔗糖3.06%、麩皮0.45%、MgSO4 0.02%。培養(yǎng)基中添加蔗糖、麩皮和MgSO4可促進花臉香蘑菌絲生長，并得到優(yōu)化后的培養(yǎng)配方，為下一步研究提供了基礎。

關鍵詞：花臉香蘑;碳源;氮源;無機鹽;生長速度

中圖分類號：S646.1+10.1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）19-0113-05

收稿日期：2019-02-11

基金項目：湖南省自然科學基金（編號：2019JJ50330）;湖南省重點研發(fā)計劃（編號：2018NK2025）。

作者簡介：陸 歡（1989—），女，湖南懷化人，碩士，助理研究員，主要從事食藥用菌保鮮與加工研究。E-mail：245450595@qq.com。

通信作者：徐 寧，博士，助理研究員，主要從事食藥用菌保鮮與加工研究。E-mail：1050353232@qq.com。

花臉香蘑[Lepista sordida（Schumach.）Singer]又名紫晶品蘑、丁香蘑、花臉蘑、紫花臉香蘑等，屬擔子菌門（Basidiomycotina）傘菌綱（Agaricomycetes）傘菌亞綱（Agaricomycetidae）傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）[1]，主要分布于亞洲（我國）、歐洲等地，我國主要分布在貴州、云南、黑龍江、遼寧、河北、河南、甘肅、青海、四川、新疆、山西、內蒙古和福建等地[2-5]。花臉香蘑氣味濃香，色澤宜人，味道鮮美，是一種藥食兩用的珍稀真菌，其蛋白質含量豐富，各種氨基酸比較齊全[6-8]，特別是鈣、鐵、胡蘿卜素和煙酸含量豐富，還含有較多的微量元素如銅、鋅、氟、碘等[9]，具有養(yǎng)血、益神、補肝和利五臟的功效，還含有多糖[10-14]、二萜[15]、抑菌物質[16-19]等生物活性成分，是香蘑屬中具有很高開發(fā)價值的優(yōu)良食用菌之一。

國內外學者對花臉香蘑研究已有幾十年，但到目前為止，花臉香蘑人工栽培還處于小規(guī)模階段，還無法大規(guī)模生產。目前關于花臉香蘑生物學特性和營養(yǎng)特性已有報道，但關于碳源、氮源和無機鹽對菌絲生長速度的影響報道極少[20-23]。本研究探討了不同碳源、氮源和無機鹽對花臉香蘑菌絲生長速度的影響及菌絲生長最佳碳源、氮源和無機鹽，還對培養(yǎng)基配方進行了優(yōu)化，為花臉香蘑的進一步研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

花臉香蘑菌株為湖南省食用菌研究所保藏菌株。

1.1.2 主要試劑和儀器

所有試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司，馬鈴薯、玉米粉、大豆粉和麩皮購自周邊市場。試管、培養(yǎng)皿等玻璃儀器，購自泰州科健醫(yī)療用品有限公司;YXQ0LS-75SⅡ立式蒸汽滅菌鍋，購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;SW-CJ-2F凈化工作臺，購自蘇州凈化設備有限公司;101-3AB電熱鼓風干燥箱，購自天津市泰斯特儀器有限公司;智能生化培養(yǎng)箱，購自臺灣斯特儀器設備有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

基礎培養(yǎng)基（1 L）：馬鈴薯200 g，瓊脂20 g。碳源試驗培養(yǎng)基：在基礎培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露醇、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、甲基纖維素，添加量均為總量的2%。氮源試驗培養(yǎng)基：在基礎培養(yǎng)基中分別添加硝酸鉀、硝酸銨、尿素、蛋白胨、麥芽浸粉、玉米粉、大豆粉、麩皮，添加量均為總量的0.5%。無機鹽試驗培養(yǎng)基：在基礎培養(yǎng)基中分別添加FeSO4、CuSO4、CaSO4、ZnSO4、MgSO4、NaCl，添加量均為總量的0.05%。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同營養(yǎng)條件對花臉香蘑菌絲生長的影響

將活化的花臉香蘑菌種于PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d，用打孔機取活化菌種塊（菌塊直徑5 mm）接于添加不同碳源、氮源和無機鹽平板（平板直徑9 cm）中，于25 ℃培養(yǎng)5～7 d，用“十”字交叉法測定菌絲生長速度，觀察菌絲長勢，選擇最合適碳源、氮源和無機鹽，每個處理5次重復。

1.2.2 不同營養(yǎng)濃度對花臉香蘑菌絲生長的影響

將活化的花臉香蘑菌塊（菌塊直徑5 mm）分別接種于不同濃度的最適碳源、氮源和無機鹽的培養(yǎng)基中，碳源濃度（C）分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%，氮源濃度（N）分別為0.1%、0.2%、03%、0.4%、0.5%、0.6%，無機鹽濃度（I）分別為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%，其他同“1.2.1”節(jié)。

1.2.3 花臉香蘑培養(yǎng)基優(yōu)化

在“1.2.1”和“1.2.2”節(jié)試驗基礎上，對花臉香蘑培養(yǎng)基進行優(yōu)化，即以馬鈴薯20%、瓊脂2%為基礎添加上述試驗得到的最適碳源、氮源和無機鹽，采用三元二次正交回歸設計對這3個因素進行組合研究，建立碳源、氮源、無機鹽與花臉香蘑菌絲生長速度之間的二次多項式回歸方程，尋找最優(yōu)的配方。試驗因素水平及編碼見表1。

以花臉香蘑菌絲生長速度為響應值Y，擬合二次多項式方程

式中：Y為菌絲生長速度的預測值;b0為常數項;bj為一次項系數;bhj為交互項系數;bjj為二次項系數;多項式方程（1）的擬合性質由確定系數R2檢驗，其統(tǒng)計學上的顯著性由F值檢驗。

1.3 數據分析

試驗數據采用DPS 9.50數據處理軟件進行曲線擬合及統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同營養(yǎng)條件對花臉香蘑菌絲生長的影響

2.1.1 不同碳源對花臉香蘑菌絲生長的影響

由表2可知，花臉香蘑菌絲生長速度和長勢在9種不同碳源培養(yǎng)基上表現(xiàn)有差異。在0.05水平上，以蔗糖為碳源生長最快，日均生長2.29 mm;其次為淀粉和麥芽糖，日均生長分別為2.06、1.95 mm;再次是甘露糖、甲基纖維素、白糖、葡萄糖、半乳糖;果糖最慢，日均生長僅為0.97 mm，說明蔗糖與其他8種碳源培養(yǎng)基之間存在顯著差異。從菌絲長勢上來看，以蔗糖、半乳糖、白糖和葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上的菌絲生長得更濃密壯實，菌絲顏色呈淺紫色。綜合生長速度和菌絲長勢，花臉香蘑菌絲生長的最佳碳源是蔗糖，說明花臉香蘑更容易吸收利用雙糖。

2.1.2 不同氮源對花臉香蘑菌絲生長的影響

由表3可知，花臉香蘑菌絲生長速度和長勢在8種不同氮源培養(yǎng)基上表現(xiàn)有差異。在0.05水平上，以麩皮為氮源生長最快，日均生長1.88 mm;其次為蛋白胨和麥芽浸粉，日均生長分別為1.65、1.56 mm;再次是玉米粉、大豆粉、KNO3、尿素;NH3Cl最慢，菌絲未生長，說明麩皮與其他7種氮源培養(yǎng)基之間存在顯著差異。從菌絲長勢上來看，菌絲顏色呈淺紫色，除尿素和NH3Cl為氮源的培養(yǎng)基之外，其余6種培養(yǎng)基的菌絲生長得較濃密。綜合生長速度和菌絲長勢，花臉香蘑菌絲生長的最佳氮源是麩皮。

2.1.3 不同無機鹽對花臉香蘑菌絲生長的影響

由表4可知，花臉香蘑菌絲生長速度和長勢在6種不同無機鹽培養(yǎng)基上表現(xiàn)有差異。在0.05水平上，以MgSO4為無機鹽生長最快，日均生長1.64 mm;其次為NaCl和CaSO4，日均生長分別為1.58、1.42 mm;再次是FeSO4、ZnSO4;CuSO4最慢，日均生長僅為0.81 mm，說明MgSO4與其他5種無機鹽培養(yǎng)基之間存在差異。從菌絲長勢上來看，菌絲顏色呈淺紫色，除CuSO4為無機鹽培養(yǎng)基之外，其余5種培養(yǎng)基的菌絲生長得較濃密。綜合生長速度和菌絲長勢，花臉香蘑菌絲生長的最佳無機鹽是MgSO4。

2.2 不同營養(yǎng)濃度對花臉香蘑菌絲生長的影響

2.2.1 不同碳源濃度對花臉香蘑菌絲生長的影響

對菌絲生長速度（YC）與碳源濃度（C）2個變量進行回歸分析，得到方程：

式中：R2=0.706，F(xiàn)=623.859，P=0.030<0.05，說明模型與實測值擬合較好，菌絲生長速度與碳源濃度達到顯著相關水平。由回歸方程（2）預測值和試驗實測值得到的結果如圖1所示，結果表明，在碳源濃度為1%～3%之間，菌絲生長速度隨著濃度增加而加快;濃度>3%后菌絲生長速度隨著濃度增加而減慢。

2.2.2 不同氮源濃度對花臉香蘑菌絲生長的影響

對菌絲生長速度（YN）與碳源濃度（N）2個變量進行回歸分析，得到方程：

式中：R2=0.988，F(xiàn)=2 769.159，P=0.014<0.05，說明模型與實測值擬合較好， 菌絲生長速度與氮源濃度達到顯著相關

水平。由回歸方程（3）預測值和試驗實測值得到的結果如圖2所示，結果表明，在氮源濃度為0.1%～0.5%之間，菌絲生長速度隨著濃度增加而加快;當氮源濃度>0.5%時，隨著氮源濃度增加，菌絲生長速度呈下降趨勢。

2.2.3 不同無機鹽濃度對花臉香蘑菌絲生長的影響

對菌絲生長速度（YI）與無機鹽濃度（I）2個變量進行回歸分析，得到方程：

式中：R2=0.997，F(xiàn)=5.042，P=0.021<0.05，說明模型與實測值擬合較好，菌絲生長速度與無機鹽濃度達到顯著相關水平。由回歸方程（4）預測值和試驗實測值得到的結果如圖3所示，結果表明，在無機鹽濃度為0.01%～0.05%之間，菌絲生長速度隨著濃度增加而加快;當無機鹽濃度>0.05%時，菌絲生長速度隨著無機鹽濃度增加而減慢。

2.3 花臉香蘑培養(yǎng)基優(yōu)化

選用蔗糖作為碳源（X1）、麩皮作為氮源（X2）、MgSO4作為無機鹽（X3），按三元二次正交回歸設計安排試驗，實施方案及試驗結果見表5。

對3個因素不同處理與花臉香蘑菌絲生長速度進行二次多項式回歸擬合，得到回歸方程（5）：

Y=1.216+0.320X1+2.512X2+1.437X3-0.040X12-1.582X22+90.893X32-0.078X1X2-0.657X1X3-14.063X2X3。（5）

對3個因素不同處理與花臉香蘑菌絲生長速度進行分析，得到復相關系數R=0.898，確定系數R2=0.806，F(xiàn)值=5.990，P=0.002<0.05，說明該回歸方程能較好地擬合不同因素對花臉香蘑菌絲生長速度的影響。剩余標準差S=0.077，調整后的復相關系數Ra=0.819，Durbin-Watson統(tǒng)計量d=2.245，接近于2。

2.3.1 各單因素對花臉香蘑菌絲生長速度的獨立效應分析

根據回歸方程（5）可知，當碳源、氮源、無機鹽3個因素中只存在1個因素，其他因素為0時，3個因素對花臉香蘑菌絲生長速度的影響差異明顯。從x軸歸一化x-y圖（圖4）可以看出，碳源濃度對花臉香蘑菌絲生長速度的影響曲線呈類似開口朝下的拋物線，在開始出現(xiàn)一定的增加，隨著濃度的增加出現(xiàn)下降趨勢;氮源濃度對花臉香蘑菌絲生長速度的影響最大，隨著濃度的增加影響曲線呈近直線增加趨勢;無機鹽濃度對花臉香蘑菌絲生長速度的影響雖最小，但隨著濃度的增加影響曲線呈增加趨勢。

2.3.2 各單因素對花臉香蘑菌絲生長速度的交互效應分析

將其他因素固定為0水平，對方程（5）進行降維分析，得到各單因素對花臉香蘑菌絲生長速度的交互作用回歸子模型：

根據方程（6）至（8）可得到每個因素對花臉香蘑菌絲生長速度的交互作用曲線圖（圖5）。結果表明，無機鹽對花臉香蘑菌絲生長速度的效應曲線是一條開口向上的拋物線，碳源濃度和氮源濃度對花臉香蘑菌絲生長速度的效應曲線近似直線。碳源濃度和氮源濃度一直為正交互作用，兩者與無機鹽濃度在<0編碼前為負交互作用，在>0編碼后為正交互作用。根據分析結果對模型進行優(yōu)化，經分析可知，當培養(yǎng)基添加3.06%蔗糖、0.45% 麩皮、0.02% MgSO4時，菌絲生長速度最快，達到 2.604 mm/d。

3 結論

碳源、氮源和無機鹽都是花臉香蘑生長所需的營養(yǎng)因子，篩選合適的營養(yǎng)因子可為花臉香蘑的菌種質量提供保障，提高后續(xù)生產產量。在9種供試碳源中，花臉香蘑對單糖、雙糖及多糖都能利用，說明培養(yǎng)花臉香蘑時可利用的碳源較廣，其中以蔗糖為碳源時菌絲生長最好，淀粉和麥芽糖對花臉香蘑菌絲生長影響次之，但對單糖的利用效果不佳，且當蔗糖濃度為2%～3%范圍時，菌絲生長速度較快。在供試的9種氮源中，花臉香蘑對有機氮源、無機氮源均能利用，從菌絲生長速度和菌絲生長情況可知，有機氮源優(yōu)于無機氮源，原因可能是有機氮源含有更豐富的生長因子，可滿足菌絲生長不同階段的不同需求及促進新陳代謝刺激生長，而無機氮源營養(yǎng)成分單一，難以滿足菌絲生長需要，其中以麩皮為氮源時菌絲生長最好，蛋白胨次之，且當麩皮濃度為0.2%～0.5%范圍時，菌絲生長速度較快。在供試6種無機鹽中，花臉香蘑對1價、2價無機離子都可以利用，其中以MgSO4為無機鹽時菌絲生長最好，NaCl次之。且當MgSO4濃度為0.01%～0.05%范圍時，菌絲生長速度較快。本試驗確定了花臉香蘑菌絲生長最適碳源為蔗糖、最適氮源為麩皮、最適無機鹽為MgSO4，優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為馬鈴薯20%、瓊脂2%、蔗糖3.06%、麩皮 0.45%、MgSO40.02%。本試驗只是針對單因子的碳源、氮源和無機鹽進行了分析，未對碳源、氮源和無機鹽進行復合組合優(yōu)化，何種組合可滿足花臉香蘑菌絲生長的營養(yǎng)需求，還須進一步研究。

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