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    雞α干擾素真核表達載體的改造及在畢赤酵母中的分泌表達

    2019-12-16 01:42:53曹丁李學優(yōu)昝繼清蘭玲峰甘祥武
    江蘇農業(yè)科學 2019年19期
    關鍵詞:干擾素

    曹丁 李學優(yōu) 昝繼清 蘭玲峰 甘祥武

    摘要:旨在利用畢赤酵母密碼子的偏好性和遺傳簡并性,將雞α干擾素優(yōu)化基因片段cIFN-α[STBX]2[STBZ]連入畢赤酵母表達載體pPIC9k,再經重疊延伸PCR方法去除重組質粒的5′端非翻譯區(qū)多余的8個核苷酸GGATCCAA,使其與畢赤酵母AOX1(醇氧化酶)的5′端非翻譯區(qū)的序列完全一致,構建并篩選重組畢赤酵母,并進行搖瓶誘導表達試驗。將表達產物用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行檢測,并用微量病變抑制法檢測其抗病毒效價??共《净钚詸z測結果顯示,天然基因、優(yōu)化基因、質粒5′端非翻譯區(qū)改造后的優(yōu)化基因重組質粒表達產物的抗病毒效價分別為105、106、1.5×106 U/mL。雞α干擾素基因優(yōu)化后的抗病毒效價提高了10倍,對質粒5′端非翻譯區(qū)進行進一步改造后,表達蛋白的抗病毒活性提高了50%,從而為雞α干擾素的工業(yè)化生產奠定了基礎。

    關鍵詞:雞α干擾素;真核表達;pPIC9k;分泌表達;抗病毒活性

    中圖分類號: Q786文獻標志碼: A

    文章編號:1002-1302(2019)19-0068-04

    收稿日期:2018-09-16

    基金項目:廣州市科技計劃(編號:201610010087)。

    作者簡介:曹 丁(1986—),女,河南南陽人,碩士,高級工程師,主要從事生物農業(yè)工程方面的研究。E-mail:caoding218@163.com。

    干擾素是一類能夠誘導人及動物細胞產生多種廣譜抗病毒蛋白的類激素蛋白,具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)等生物學活性,可有效解決禽類的疫病泛濫問題,并能夠解決應用抗生素造成的菌群失調、出現(xiàn)耐藥性菌株及藥物的不良反應等問題[1-2]。畢赤酵母是近年來發(fā)展起來的一種以甲醇為碳源的真核表達系統(tǒng),酵母可對異源蛋白進行修飾,采用有信號肽的質粒時,蛋白能被正確折疊和加工,然后被分泌到培養(yǎng)基中。畢赤酵母分泌蛋白除了具有與哺乳動物細胞表達蛋白許多相似的優(yōu)點外,還具有操作簡便、營養(yǎng)要求低、培養(yǎng)價格低廉、便于高密度發(fā)酵、高產分泌表達外源蛋白以及表達產物易于純化等優(yōu)點[3-4]。因此,基于畢赤酵母的表達系統(tǒng),可以有效地高表達重組雞α干擾素。

    雞α干擾素作為禽類干擾素中的代表,其抗病毒作用較強。本研究為了解決天然雞α干擾素基因表達量低下等問題,在其成熟肽序列的基礎上,選用畢赤酵母偏好性密碼子,人工合成其優(yōu)化基因序列,并在基因序列前加入蛋白酶切割位點,使其表達蛋白具有天然的N端。此外,將連入的真核表達載體pPIC9k的5′端非翻譯區(qū)(5′UTR)序列進行改造,去除多余的8個堿基序列,使其與畢赤酵母AOX1(醇氧化酶)的mRNA序列完全一致,并初步研究了改造載體在畢赤酵母SMD1168中的表達和抗病毒活性,以期提高雞α干擾素的表達水平,解決其在工業(yè)生產中的瓶頸問題。

    1 材料與方法

    1.1 供試菌株和質粒

    pPIC9k質粒、大腸桿菌DH5α、畢赤酵母SMD1168和水泡性口炎病毒(VSV),均由廣東省微生物種質資源庫保存。

    1.2 主要試劑

    PFU(高保真DNA聚合酶) Mix、DNA膠回收試劑盒、質粒DNA小量提取試劑盒、引物、核酸染色劑、瓊脂糖,購自生工生物工程(上海)股份有限公司;T4 DNA連接酶、限制性內切酶、G418、DNA marker、蛋白質marker,購自TaKaRa公司;酵母抽提物、胰蛋白胨,購自英國Oxoid公司;瓊脂粉,購自廣州環(huán)凱生物科技有限公司;其他試劑均為國產分析純。

    1.3 主要儀器設備

    主要儀器與設備有生化培養(yǎng)箱、DHZ-DA大容量全溫振蕩器、752N型紫外可見分光光度計、PCR儀、恒溫金屬浴、水平/垂直電泳儀、藍光切膠儀、顯微鏡、電子天平、pH值等。

    1.4 引物的設計與合成

    根據(jù)GenBank上發(fā)表的雞α干擾素成熟肽序列,同時遵循畢赤酵母密碼子使用的偏好性和遺傳簡并性原則,選用畢赤酵母的偏愛密碼子[5],用Primer 5.0軟件設計12條引物P1~P12,運用重疊延伸PCR方法人工合成cIFN-α基因序列[6]。插入畢赤酵母表達載體pPIC9k,在5′端起始密碼子前選擇酶切位點EcoR Ⅰ,在3′端終止密碼子后選擇酶切位點Not Ⅰ,在目的基因前面加入kex2、Ste13蛋白酶裂解位點,使外源基因表達產物具有天然的N端,并利用載體上的α信號肽序列得到分泌表達。

    1.5 雞α干擾素成熟肽優(yōu)化基因序列的SOE(重疊延伸基因擴增技術)

    取引物P1~P4(10 μmol/L)各2 μL,PFU Mix 25 μL,用雙蒸水補至50 μL,PCR反應程序如下:94 ℃ 3 min,(94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s)×30個循環(huán),72 ℃ 10 min。每組分別以P1~P4引物為第1組,P5~P8引物為第2組,P9~P12引物為第3組,按相同條件進行PCR擴增,將反應產物分別在1%瓊脂糖凝膠中電泳,用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收,將回收產物分別標記為D1、D2、D3。

    取D1、D2、D3各2 μL,引物P1、P12各1 μL,PFU Mix 25 μL,補充雙蒸水至總體積為50 μL,PCR反應程序如下:94 ℃ 3 min,(94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s)×30個循環(huán),72 ℃ 10 min。將反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收,該回收產物即為擴增的雞α干擾素成熟肽優(yōu)化基因序列,標記為cIFN-α[STBX]2[STBZ],雞α干擾素成熟肽天然基因標記為cIFN-α[STBX]1[STBZ]。

    1.6 cIFN-α重組表達載體的構建

    將cIFN-α2基因片段和pPIC9k質粒分別進行EcoR Ⅰ、Not Ⅰ雙酶切后連接,轉化大腸桿菌DH5α,構建表達載體pPIC9k-cIFN-α2。將轉化菌落經菌落PCR鑒定,提取陽性質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。

    1.7 pPIC9k-cIFN-α2的5′非翻譯區(qū)的改造

    將pPIC9k表達載體的非翻譯區(qū)序列與畢赤酵母全基因序列中的AOX1基因序列進行比較,發(fā)現(xiàn)pPIC9k質粒的5′非翻譯區(qū)多出了8個核苷酸序列GGATCCAA,本試驗通過設計4條引物,應用PCR方法擬去除表達重組載體信號肽mRNA 5′-UTR序列中的GGATCCAA序列[7]。首先在載體上改造位點(GGATCCAA)的上游找到Sac Ⅰ酶切位點,在目的基因下游找到Not Ⅰ酶切位點,設計3條引物E1、E2、E3,其中E1含有酶切位點Sac Ⅰ,E2、E3有互補序列,且內部人為去除GGATCCAA序列,分別以E1、E2以及E3、P12為引物,以pPIC9k-cIFN-αR質粒為模板進行PCR擴增,可擴增得到長度分別為732、824 bp左右的片段A、B。再將片段A、B進行切膠回收后,用引物E1、P12利用重疊延伸PCR方法擴增得到片段C,大小為1 532 bp。將片段C回收后與pPIC9k質粒經SacⅠ、NotⅠ雙酶切后連接,即得到重組5′UTR區(qū)改造質粒pPIC9k-cIFN-αR,進一步進行序列測定以驗證結果。最終實現(xiàn)去掉5′-UTR多余的8個堿基,使得經過改造的質粒pPIC9k的5′-UTR與酵母基因組的AOX1完全相同,從而降低了可能引起的表達量降低或者不表達的可能性。

    1.8 重組質粒轉化SMD1168的篩選和鑒定

    將重組質粒經限制性內切酶SacⅠ進行單酶切后,電擊轉化畢赤酵母SMD1168,將轉化后的酵母細胞涂布于MD(最小葡萄糖培養(yǎng)基)平板進行培養(yǎng),直至長出單菌落。挑選轉化子菌落,用裂解液進行PCR模板的制備,用通用引物α-factor、3′AOX進行PCR擴增,將篩選到的陽性轉化子經濃度逐漸增高的G418抗生素篩選高拷貝克隆,用于表達目的蛋白。

    1.9 雞α干擾素的誘導表達及檢測

    選取耐受2.0 mg/mL G418抗生素濃度的單菌落,每種重組質粒各選取3個,以pPIC9k空質粒轉化酵母作為陰性對照。將畢赤酵母從活化平板接種至YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基)搖瓶,于28 ℃、220 r/min 培養(yǎng)24 h,從YPD搖瓶中按1%的接種量接至BMGY(最小甘油緩沖液培養(yǎng)基)搖瓶中,于28 ℃、220 r/min培養(yǎng)16 h,4 000 r/min離心10 min取沉淀;用等體積的BMMY(最小甲醇緩沖液培養(yǎng)基)培養(yǎng)基重新懸浮菌體,于28 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h后,補加1%甲醇和磷酸鉀溶液1次,48 h后結束培養(yǎng)。將BMMY搖瓶菌液于12 000 r/min離心10 min,取上清,用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,對過濾上清進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和抗病毒活性檢測。

    1.10 重組雞α干擾素的抗病毒活性檢測

    采用微量細胞病變抑制法[8]測定重組雞α干擾素的抗病毒活性,具體步驟如下:取孵化9~10 d的SPF(無特定病原體)雞胚,去頭、四肢及內臟,在無菌狀態(tài)下用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗3遍后,剪碎,用0.25%胰酶于37 ℃消化后,再用無血清營養(yǎng)液洗去胰酶,并用大孔吸管吹打成單個細胞后上96孔板,生長約12 h使細胞全部貼壁生長至單層后,去除生長液。每孔加入10倍倍比稀釋的干擾素(用無血清營養(yǎng)液稀釋)共 100 μL,每個稀釋度設6孔平行樣,孵育12 h后用100 TCID50劑量的水泡性口炎病毒進行攻毒,同時設陽性對照孔(不加干擾素,只加病毒)、陰性對照孔(只加干擾素,不加病毒)、空白對照孔(不加干擾素,不加病毒),大約12~24 h后在倒置顯微鏡下觀察結果。當陽性對照孔出現(xiàn)75%以上病變時,判斷結果,以能抑制50%細胞病變的樣品干擾素稀釋度定義為1個單位干擾素。

    2 結果與分析

    2.1 雞α干擾素成熟肽優(yōu)化基因的擴增及重組表達質粒的構建

    PCR擴增后的cIFN-α2基因產物片段經瓊脂糖凝膠電泳檢測后,發(fā)現(xiàn)有1條清晰的條帶(圖1-a),預期大小為 696 bp,與DNA marker相比,大小與預期相符,回收后測序表明,序列正確,與設計相符合。

    將cIFN-α2基因片段雙酶切后連入pPIC9k表達載體,用通用引物α-factor、3′AOX進行菌落PCR篩選陽性克隆,將擴增條帶進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果有明顯條帶被擴增出來,與DNA marker比對可知,位于750 bp附近。擴增出來的片段預計大小為696 bp,與PCR檢測的結果基本相符。選擇3個陽性克隆保種、提質粒,送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,結果表明,載體連入序列正確,得到含雞α干擾素成熟肽優(yōu)化基因的pPIC9k表達載體。

    2.2 pPIC9k-cIFN-α2的5′非翻譯區(qū)的改造

    將擴增后的A、B、C片段進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,發(fā)現(xiàn)在目標位置均有1條清晰的條帶,經檢測,大小正確,說明擴增成功(圖2-a)。用通用引物對pPIC9k-cIFN-α2啟動子改建轉化子的菌落PCR結果顯示,擴增有明顯條帶(圖2-b),與DNA marker相比,位于1 600 bp附近。由于鑒定PCR中采用的是E1、3′AOX引物,因此擴增出來的片段大小應該是1 532 bp,與PCR檢測的結果基本相符(圖2-a)。選擇3個陽性克隆保種、提質粒,送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,結果表明,載體連入序列正確,得到含有雞α干擾素成熟肽優(yōu)化基因的5′UTR區(qū)改造質粒pPIC9k-cIFN-α2-E。

    2.3 重組畢赤酵母的鑒定

    將重組畢赤酵母菌株用通用引物α-factor、3′AOX進行酵母菌落PCR驗證,如圖3所示,篩選到的重組畢赤酵母在目標位置出現(xiàn)了明顯條帶,與預期的696 bp一致,證明線性化的重組質粒已經被成功整合至畢赤酵母基因組中。

    2.4 雞α干擾素的表達檢測

    對篩選到的高拷貝陽性畢赤酵母重組子SMD1168-pPIC9k-cIFN-α1、SMD1168-pPIC9k-cIFN-α2、SMD1168-pPIC9k-cIFN-α2-E進行搖瓶誘導表達試驗,分別取48 h表達上清進行12%SDS-PAGE。由圖4可以看出,在20 ku左右出現(xiàn)特異蛋白條帶,與預期分子量大小19 ku基本相符,而陰性對照未重組的SMD1168與空質粒轉化對照SMD1168-pPIC9k未出現(xiàn)相應條帶。光密度掃描結果顯示,雞α干擾素優(yōu)化基因重組酵母的蛋白表達量大于天然基因重組酵母SMD1168-pPIC9k-cIFN-α1。

    2.5 重組酵母表達雞α干擾素抗病毒活性的測定

    病毒抑制法測定酵母表達產物的抗病毒活性結果顯示,攻毒24 h后觀察到陽性對照孔出現(xiàn)100%的病變,陰性對照孔中是正常的雞胚成纖維細胞。從表1可以看出,雞α干擾素基因的優(yōu)化可以提高其表達水平,抗病毒效價明顯提高了

    10倍;在優(yōu)化基因重組畢赤酵母的基礎上,對質粒5′端非翻譯區(qū)進行進一步改造后,表達蛋白的抗病毒活性提高了約50%。

    3 討論與結論

    研究表明,mRNA的5′端非翻譯區(qū)序列組成和長度可影響翻譯效率,畢赤酵母是1種甲醇營養(yǎng)型酵母,能夠以甲醇為唯一碳源生長[9]。與甲醇代謝相關的醇氧化酶AOX1基因受甲醇的嚴格調控并啟動高效表達,醇氧化酶占細胞可溶性蛋白的35%,而對應的mRNA僅僅占總mRNA的5%以下[10],說明醇氧化酶mRNA的翻譯效率極高,其5′端非翻譯區(qū)有利于目的蛋白在畢赤酵母中的表達。

    Sreekrishna等通過改建人血清蛋白mRNA,使其與甲醇氧化酶基因AOX1 mRNA的5′UTR相同,結果發(fā)現(xiàn),其表達水平提高了50倍以上[11],說明AOX1的5′UTR對目的基因表達水平的影響比較大,具有相同的5′UTR有利于目的基因在畢赤酵母中的表達翻譯,而pPIC9k質粒的5′UTR與AOX1的5′UTR的序列相比,多了8個堿基GGATCCAA,這可能成為限制目的蛋白表達的重要因素之一。

    近年來的多數(shù)研究表明,由于不同物種對同義密碼子的使用頻率不同,外源基因,尤其是來自較遠物種的基因在宿主中的表達會受到一定影響,通過對外源基因的密碼子進行優(yōu)化,可以提高其表達水平[12]。本研究運用PCR方法,將pPIC9k質粒5′UTR的8個核苷酸序列去除,使其與AOX1 的5′UTR序列相同,并對其雞α干擾素的密碼子進行了優(yōu)化,將獲得的重組菌株在搖瓶水平進行了甲醇誘導表達。檢測結果表明,與天然基因相比,密碼子優(yōu)化后的雞α干擾素重組酵母菌株的表達量得到了提高,抗病毒活性提高了10倍,在此基礎上,對pPIC9k質粒的5′UTR進行改造后,抗病毒活性提高了50%,說明其mRNA的5′非翻譯區(qū)的改造能有效提高雞α干擾素在畢赤酵母中的表達。本研究為提高雞α干擾素的工程菌表達效果提供了新的思路。

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