骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的腎病綜合征模型鼠腎小球的實(shí)驗(yàn)研究

黃青　凌志杰　鄒毓華　鐘小明　楊赟　張明?！×_開源

[摘要]目的 觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）移植對腎病綜合征模型鼠腎小球的作用，探討B(tài)MSCs保護(hù)腎病綜合征模型鼠腎小球的可能性及其機(jī)制。方法 從SD大鼠骨髓中提取、分離、純化、擴(kuò)增和鑒定BMSCs。21日齡剛斷奶的SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，篩選尿蛋白濃度<0.8 g/L作為實(shí)驗(yàn)用鼠。隨機(jī)選取5只實(shí)驗(yàn)用鼠作為正常對照稱A組。其余實(shí)驗(yàn)鼠按照Bertani法尾靜脈注射鹽酸阿霉素制作腎病綜合征模型鼠。成模后隨機(jī)分成B、C和D組，每組5只，分別給予尾靜脈注射生理鹽水、潑尼松灌胃和尾靜脈移植BMSCs細(xì)胞懸液。各組大鼠造模前、后，干預(yù)后1、4、8周分別進(jìn)行24 h尿蛋白定量;干預(yù)結(jié)束后，處死各組實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行腎臟病理檢查和nephrin、podocin mRNA的測定。結(jié)果 造模前，4個實(shí)驗(yàn)組的尿蛋白定量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。造模后，B、C和D組的尿蛋白定量高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但B、C和D組內(nèi)兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。干預(yù)后，B、C和D組的尿蛋白定量均高于同期A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;B、C和D組內(nèi)兩兩比較：C、D兩組的尿蛋白定量均低于同期B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但同期C、D兩組的尿蛋白定量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。干預(yù)結(jié)束后，在電鏡下觀察實(shí)驗(yàn)各組的腎臟損傷程度為B>C>D>A;B、C和D組的腎小球足細(xì)胞相關(guān)分子nephrin mRNA的表達(dá)均低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），B、C和D組內(nèi)兩兩比較：C、D組高于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但C、D組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;相關(guān)分子podocin mRNA的表達(dá)實(shí)驗(yàn)各組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 BMSCs移植可保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的腎病綜合征模型鼠的腎小球損傷，其機(jī)制可能為通過上調(diào)腎小球足細(xì)胞的nephrin mRNA的表達(dá)減輕腎小球損傷和降低蛋白尿。

[關(guān)鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;腎病綜合征;阿霉素;鼠;足細(xì)胞相關(guān)分子

[中圖分類號] R332? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）10（b）-0016-06

[Abstract] Objective To observe the effect of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） transplantation on the glomeruli of model rats with nephrotic syndrome （NS）， and to explore the possibility and mechanism of BMSCs in protecting the glomeruli of model rats with NS. Methods The BMSCs were extracted， isolated， purified， amplified and identified form bone marrow of SD rats. After adaptive feeding of 21-day-old weaned SD rats， urinary protein concentration <0.8 g/L was selected as experimental rats. Five experimental rats were randomly selected as normal control named group A. The other experimental mice were injected with Adriamycin Hydrochloride into tail vein according to Bertani method to make NS model rats. After molding， the rats were randomly divided into group B， C and D， and each group had 5 rats， and each group was given saline by tail vein injection， Prednisone by stomach and BMSCs cell suspension by tail vein transplantation. Urinary protein was quantified 24 hours before and after the model establishment and 1， 4 and 8 weeks after the intervention. After the intervention， rats in each group were sacrificed for renal pathological examination and nephrin and podocin mRNA determination. Results There was no statistically significant difference in urinary protein quantitation among the four experimental groups before model establishment （P>0.05）. The urinary protein quantitation of group B， C and D was higher than that of group A after model establishment respectively， and the differences were statistically significant （P<0.05）， but there was no significant difference between groups B， C and D （P>0.05）. After intervention， the urinary protein quantitation of group B， C and D was higher than that of group A at the same time respectively， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Two comparisons in group B， C and D： the urinary protein quantitation in group C and D was lower than that in group B at the same time respectively， with significant differences （P<0.05）， but there was no significant difference in the urinary protein quantitation between group C and D at the same time （P>0.05）. After the intervention， the degree of kidney injury in the experimental groups was B>C>D>A under electron microscope. The expression of nephrin in glomerular podocyte-related molecule in group B， C and D was lower than that in group A respectively， and the differences were statistically significant （P<0.05）， two comparisons in group B， C and D： group C and D was higher than that of group B respectively， and the differences were statistically significant （P<0.05）， but there was no significant difference between groups C and D （P>0.05）. There were no significant differences in the expression of podocin mRNA between experimental groups （P>0.05）. Conclusion BMSCs transplantation can protect the glomerular injury of model rats with Adriamycin-induced NS. The mechanism may be to reduce glomerular injury and proteinuria by up-regulating the expression of nephrin mRNA in glomerular podocytes.

[Key words] Bone marrow mesenchymal stem cells; Nephrotic syndrome; Adriamycin; Rat; Podocyte-associated molecules

腎病綜合征（nehprotic syndrome，NS）是一種以大量蛋白尿、低蛋白血癥、高膽固醇血癥和水腫為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。NS多為原發(fā)性，發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前的研究表明，免疫失調(diào)導(dǎo)致的腎小球足細(xì)胞損傷與NS發(fā)病密切相關(guān)[1]。NS多見于兒童及青少年，約80%為微小病變型[2]。微小病變型腎病綜合征（minimal change nehprotic syndrome，MCNS）以彌漫性腎小球臟層上皮細(xì)胞足突消失或融合為主，目前臨床上多采用以糖皮質(zhì)激素為主的綜合治療。兒童正處于生長發(fā)育關(guān)鍵期，大量蛋白尿和長期服用激素等會影響患兒的生長發(fā)育和心身健康。此外，根據(jù)國際小兒腎臟研究組[3]報道約有20%的NS患兒可出現(xiàn)激素耐藥表現(xiàn)。因此，探索一種安全有效的治療方法已成為兒科臨床亟待解決的問題。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）具有增殖、分化、分泌和免疫調(diào)節(jié)等功能。近年來很多學(xué)者研究表明，BMSCs在損傷修復(fù)、再生、免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要作用[4]。本研究采用體外擴(kuò)增的大鼠BMSCs經(jīng)尾靜脈途徑移植進(jìn)入阿霉素誘導(dǎo)的MCNS鼠模型體內(nèi)，觀察蛋白尿和足細(xì)胞情況探索其療效和機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

60～80 g和斷奶日齡為21 d的雄SD大鼠均購于贛南醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心[SCXK（贛）2014-0001，清潔級]，實(shí)驗(yàn)中SD大鼠飼養(yǎng)和處置均符合實(shí)驗(yàn)動物倫理原則。

1.2主要儀器與試劑

主要儀器：流式細(xì)胞儀（COULERT，EPICS XL型），PCR儀（BIOER，F(xiàn)QD-48A）;主要試劑：大鼠淋巴細(xì)胞分離液（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，LTS1083P）、胎牛血清（Hycolne，SH30396.03）、DMEM-LG（Hycolne，SH30272.01），注射用鹽酸阿霉素粉針劑10 mg（海正輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H33021980）、總RNA提取試劑盒Ⅱ （OMEGA，R6934-02），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas，K16 22），SYBR Green Ⅰ Realtime PCR試劑盒（Takala，208 054），2×PCR master mix（Fermentas，K0171）。

1.3 BMSCs提取、培養(yǎng)及鑒定

60～80 g雄性SD大鼠頸椎脫臼處死，取出雙股骨和脛骨。PBS沖洗骨髓腔，經(jīng)大鼠淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞。用貼壁法純化培養(yǎng)BMSCs。培養(yǎng)基為含10 % 胎牛血清、100 U/L青、鏈霉素、2 mmol/L谷胺酰胺的DMEM-LG完全培養(yǎng)基。通過流式細(xì)胞術(shù)和誘導(dǎo)分化對BMSCs種子細(xì)胞進(jìn)行鑒定。鑒定合格后種子細(xì)胞按梯度降溫法進(jìn)行凍存。待移植前，取出BMSCs種子細(xì)胞復(fù)蘇后擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組及處理

1.4.1造模? 斷奶日齡為21 d的雄性SD大鼠，體重為（40±8.5） g，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，測尿蛋白值<0.8 g/L者作為實(shí)驗(yàn)用鼠。隨機(jī)抽取5只實(shí)驗(yàn)用鼠作為正常對照命名為A組，其余實(shí)驗(yàn)用鼠按Bertani法[5]進(jìn)行造模。注射用鹽酸阿霉素粉針劑10 mg，臨時用生理鹽水配成2 mg/ml的溶液，非麻醉下尾靜脈一次性按7.5 mg/kg體重注射阿霉素，14 d后尿蛋白定量>30 mg/24 h表示造模成功，認(rèn)定為NS模型鼠并隨機(jī)分成B、C、D組，每組各5只。

1.4.2分組處理? 將P4～P5代BMSCs，配成濃度約1×106個/ml的細(xì)胞懸液，在D（干細(xì)胞治療）組大鼠成模后的第2天和第8天分別經(jīng)尾靜脈注射2 ml BMSCs懸液（約2×106個BMSCs）。與D組干預(yù)相同時間，A（正常對照）、B（空白對照）兩組大鼠經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水。C（激素治療）組大鼠在成模后第2天開始按潑尼松5 mg/（kg·d）灌胃給藥，連續(xù)給藥8周。? ? 1.5觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1尿蛋白定量及檢測方法? 將實(shí)驗(yàn)鼠置入代謝籠中，代謝籠下置干凈空瓶。為防止尿液變質(zhì)，空瓶中預(yù)先加入1 ml的甲醛。24 h后，收集尿液送檢驗(yàn)科測量尿液總體積和尿蛋白濃度，計算得出24 h尿蛋白量。收集次數(shù)與時間：①第1次（造模前），購買回SD大鼠適應(yīng)性培養(yǎng)第7天。②第2次（造模后），模型鼠注射阿霉素第14天。③第3次（干預(yù)后4周），以D（干細(xì)胞治療）組首次干預(yù)后第4周。④第4次（干預(yù)后8周），以D（干細(xì)胞治療）組首次干預(yù)后第8周。

1.5.2腎臟病理及檢查方法? 干預(yù)結(jié)束后，頸椎脫臼法處死大鼠，無菌條件下快速取出雙腎。其中左腎用無菌剪刀分成上下兩份，上份經(jīng)10%甲醛液固定，進(jìn)行石蠟包埋、切片和六胺銀染色，用于電鏡觀察。

1.5.3足細(xì)胞相關(guān)分子nephrin、podocin mRNA及檢測方法? 無菌取出的右腎，用剪刀分成約100 mg大小，立即置入液氮中用于RT-PCR。引物設(shè)計參照文獻(xiàn)[6]，RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間采用One-Way ANOVA和組內(nèi)進(jìn)行Bonferroni-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 BMSCs鑒定

2.1.1 BMSCs表型? P5代對數(shù)生長期的BMSCs經(jīng)用流式細(xì)胞儀檢測后，BMSCs表型CD90+、CD29+，CD45-、CD34-（圖1），其中 CD90、CD29、CD45、CD34-陽性細(xì)胞群的熒光吸收峰分別為98.2%、99.1%、1.32%和1.01%。

2.1.2 BMSCs分化? 成脂誘導(dǎo)2周后進(jìn)行油紅O染色，可見染成紅色的脂肪細(xì)胞（圖2）。成骨誘導(dǎo)3周后進(jìn)行VonKossa染色，可見分化的成骨細(xì)胞包漿內(nèi)有黑色物質(zhì)沉淀物（圖3）。

2.2實(shí)驗(yàn)各組造模前、造模后、干預(yù)后不同時間24 h尿蛋白定量的比較

造模前，4個實(shí)驗(yàn)組的尿蛋白定量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。造模后，B、C和D組的尿蛋白定量均高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但B、C和D組內(nèi)兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。干預(yù)后1、4、8周，B、C和D組的尿蛋白定量均高于同期A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;B、C和D組內(nèi)兩兩比較：C、D兩組的尿蛋白定量均低于同期B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但同期C、D兩組的蛋白尿定量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.3腎臟病理

干預(yù)結(jié)束后，在電鏡下觀察各組腎臟病理結(jié)果：圖4A為正常對照大鼠腎臟電鏡下無明顯異常，圖4B為空白對照大鼠腎臟電鏡下可見腎小球臟層足細(xì)胞明顯空泡變性，系膜區(qū)可見較多電子致密物沉積，足突廣泛融合（+++）。圖4C為激素治療組，電鏡下腎小球臟層足細(xì)胞空泡變性較少，可見局灶節(jié)段性足細(xì)胞融合（+），系膜區(qū)少量電子致密沉淀物。圖4D干細(xì)胞移植組，電鏡下腎小球臟層足細(xì)胞空泡變性極少，可見局灶節(jié)段性足細(xì)胞融合（+），系膜區(qū)未見電子致密沉淀物。

2.4 足細(xì)胞相關(guān)分子nephrin、podocin mRNA表達(dá)

圖5為足細(xì)胞相關(guān)分子nephrin、podocin mRNA Real time PCR電泳結(jié)果，圖6為各基因采用2-△△Ct相對定量的方法進(jìn)行統(tǒng)計結(jié)果。Ct值為定量PCR儀檢測到反應(yīng)體系中熒光信號的強(qiáng)度值，△△Ct=（Ct目的基因-Ct管家基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct管家基因）正常對照組。采用2-△△Ct可以得到nephrin、podocin基因相對于β-actin基因的相對定量值。足細(xì)胞相關(guān)分子nephrin mRNA的表達(dá)B、C和D組均低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;B、C和D組內(nèi)兩兩比較：C、D組均高于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但C、D組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;相關(guān)分子podocin mRNA的表達(dá)實(shí)驗(yàn)各組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3討論

NS是兒童泌尿系統(tǒng)的常見病，多為原發(fā)性，以微小病變型居多。MCNS的光鏡下腎小球基本正常，電鏡下彌漫性腎小球臟層上皮細(xì)胞足突消失[7]。阿霉素誘導(dǎo)的腎病綜合征鼠模型于1982年由Bertani等率先報道，具有造模簡便、成功率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，是公認(rèn)較好MCNS鼠模型[8]。本實(shí)驗(yàn)采用Bertain法，尾靜脈一次性大劑量（7.5 mg/kg）注射鹽酸阿霉素進(jìn)行造模，注射14 d后尿蛋白定量均>30 mg/24 h，成模率達(dá)100%。

BMSCs是骨髓來源的成體干細(xì)胞，具有干細(xì)胞的增殖、分化、旁分泌、免疫調(diào)節(jié)、低免疫源性和損傷修復(fù)等功能。本實(shí)驗(yàn)通過體外誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs成功分化成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，這與文獻(xiàn)[9]報道結(jié)果相符。此外，BMSCs還可分化為骨細(xì)胞[10]、軟骨細(xì)胞[11]、神經(jīng)細(xì)胞[12]等細(xì)胞。除了分化外，BMSCs還可分泌多種細(xì)胞因子，如肝細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子-1、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等[13-16]。BMSCs具有取材方便，提取分離簡單的優(yōu)點(diǎn)，是目前研究最多的成體干細(xì)胞。Yang等[17]在BMSCS移植治療局灶節(jié)段性腎小球硬化鼠模型的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：BMSCs移植可能通過上調(diào)MMP/TIMP和下調(diào)IL-6、TNF-α來降低尿蛋白、血肌酐和尿素氮水平。Jiao等[18]在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：BMSCs移植能通過激活Wnt/β-Catenin通路減少順鉑誘導(dǎo)的腎損傷。劉倩等[19]研究發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞移植能減輕阿霉素誘導(dǎo)的腎病綜合征鼠模型蛋白尿水平。

本研究中，造模前，4個實(shí)驗(yàn)組SD大鼠的尿蛋白定量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。造模后，模型（B、C、D）組的尿蛋白定量明顯高于正常對照（A）組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;模型組組內(nèi)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。干預(yù)后1、4、8周，激素治療（C）組和干細(xì)胞移植（D）組模型鼠尿蛋白水平低于空白對照（B）組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;激素治療組和干細(xì)胞移植組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示BMSCs移植能減輕阿霉素誘導(dǎo)的MCNS鼠模型蛋白尿。

MCNS蛋白尿的產(chǎn)生主要與腎小球?yàn)V過膜的結(jié)構(gòu)與功能的受損有關(guān)。電鏡下觀察實(shí)驗(yàn)各組大鼠腎臟發(fā)現(xiàn)：正常對照組無明顯異常;空白對照組腎小球臟層足細(xì)胞明顯空泡變性，系膜區(qū)可見較多電子致密物沉積，足突廣泛融合（+++）;激素治療組腎小球足細(xì)胞少量空泡變性，可見局灶節(jié)段性足細(xì)胞融合（+），系膜區(qū)少量電子致密沉淀物。干細(xì)胞移植組腎小球臟層足細(xì)胞空泡變性極少，可見局灶節(jié)段性足細(xì)胞融合（+），系膜區(qū)未見電子致密沉淀物。病理結(jié)果表明：BMSCs移植能減輕阿霉素對腎臟的損傷。

腎小球足細(xì)胞及其足突間的裂孔隔膜是腎小球?yàn)V過膜的重要部分[20]。nephrin在腎臟中只表達(dá)于足細(xì)胞。nephrin蛋白是裂孔膜柵欄樣結(jié)構(gòu)的重要部分。nephrin分子胞外區(qū)與相鄰足突nephrin分子交互形成濾過網(wǎng)，與裂孔隔膜一起阻止血漿蛋白漏入尿液中[21]。本課題組通過檢測腎小球足細(xì)胞相關(guān)分子nephrin和nephrin mRNA的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，模型組的腎小球足細(xì)胞相關(guān)分子nephrin mRNA的表達(dá)均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。模型組組內(nèi)比較干細(xì)胞治療組和激素治療組均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但干細(xì)胞移植組和激素治療組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示阿霉素誘導(dǎo)能下調(diào)nephrin mRNA的表達(dá)，BMSCs移植可上調(diào)nephrin mRNA的表達(dá)。因此，本課題組認(rèn)為，BMSCs可能通過上調(diào)nephrin mRNA的表達(dá)來減輕阿霉素對腎小球足細(xì)胞的損傷。

綜上所述，BMSCs移植能保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的MCNS模型鼠的腎小球損傷。其可能機(jī)制為BMSCs通過上調(diào)nephrin mRNA的表達(dá)，減少足細(xì)胞空泡樣變性和足突融合保護(hù)腎小球，從而降低蛋白尿水平。

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（收稿日期：2019-07-31? 本文編輯：許俊琴）