CXCR2蛋白在結(jié)腸腺癌組織中的表達(dá)及意義*

劉鴻章， 劉力， 周超熙， 李欣慧， 侯敏， 張剛， 劉超， 張濤， 賈雄杰， 林坤峰， 劉曉銳， 張愛民， 趙繼東, 張香梅△

河北大學(xué)附屬醫(yī)院 1普外科， 2乳腺中心， 5功能科(河北保定 071000)；河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 3外二科， 4腫瘤研究所， 9胸外科(河北石家莊 050011)； 6保定市第一中心醫(yī)院普外科(河北保定 071000)； 7天津市胸科醫(yī)院麻醉科(天津 300222)； 8安新縣中醫(yī)院外科(河北保定 071000)

結(jié)腸癌(colon cancer)是世界范圍內(nèi)的常見惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈明顯上升的趨勢[1]?，F(xiàn)有的手術(shù)、化療、放療等治療方式，對降低病死率、改善預(yù)后的程度有限，患者5年生存率僅50%左右。局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是疾病治療失敗的關(guān)鍵原因，探尋預(yù)測結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)及治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義[2]。趨化因子及其受體在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用[3]。CXCR趨化因子受體2型(CXCR2)在黑色素瘤、肺癌等的血管生成、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[4]。腫瘤的生長和進(jìn)展依賴于自身誘導(dǎo)的新生血管形成，腫瘤微環(huán)境中負(fù)責(zé)血管生成的內(nèi)皮細(xì)胞主要通過表達(dá)CXCR2及相關(guān)因子來實(shí)現(xiàn)這一過程[5]。幾個CXCR2參與腫瘤進(jìn)展和血管生成的小鼠腫瘤模型證明，CXCR2及相關(guān)趨化因子的耗竭顯著抑制了腫瘤生長，其機(jī)制與腫瘤微血管密度降低相關(guān)[6-8]。人腫瘤組織中CXCR2的表達(dá)水平升高與肝癌、腎癌、肺癌和胃癌的進(jìn)展及不良預(yù)后顯著相關(guān)[9-11]。然而，CXCR2在結(jié)腸腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況尚不清楚。本研究擬通過檢測CXCR2 蛋白在結(jié)腸癌及癌旁組織中表達(dá)情況，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系，為結(jié)腸癌的診療及預(yù)后監(jiān)測提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月至2015年12月于河北大學(xué)附屬醫(yī)院腹部外科及河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外二科接受結(jié)腸癌根治術(shù)的 87例結(jié)腸癌患者癌組織石蠟標(biāo)本及臨床病理資料。其中，男41例，女46例，年齡41～79歲, 中位年齡53歲。同時收集相應(yīng)的癌旁組織87例(取自結(jié)腸癌根治術(shù)中切除的病灶殘端，距離癌組織邊緣3 cm 以上，切緣陰性)。參照美國癌癥聯(lián)合會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)第8版分期系統(tǒng)對腫瘤進(jìn)行分期，其中Ⅰ期16例，Ⅱ期34例，Ⅲ期37例。選取患者的病理組織學(xué)類型均為結(jié)腸腺癌，術(shù)前均未接受過化療、放療及靶向治療，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 CXCR2鼠抗人單克隆抗體、DAB顯色試劑盒、抗鼠免疫組化檢測試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，檸檬酸抗原修復(fù)液、PBS緩沖液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，山羊血清封閉液購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，經(jīng)常規(guī)脫水透明石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，免疫組化Max Vision TM一步法檢測所有患者病理組織的CXCR2表達(dá)情況，并按照最新標(biāo)準(zhǔn)復(fù)診原有病理切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，以3% H2O2室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。石蠟切片浸入檸檬酸鈉緩沖液熱(pH=6.0)抗原修復(fù)3 min，自然冷卻20 min。滴加鼠抗CXCR2 單克隆抗體(1∶300)，4℃孵育過夜。滴加酶標(biāo)記的二抗，室溫濕盒中孵育30 min。DAB顯色，蘇木精襯染，常規(guī)酒精梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、光鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中以鼠源IgG1代替一抗作為同種型陰性對照。用慢性扁桃體炎組織切片作陽性對照。

1.2.3 免疫組化結(jié)果判定CXCR2表達(dá)水平的評分 所有免疫組化染色結(jié)果均經(jīng)兩位高年資病理科醫(yī)生獨(dú)立閱片完成。每張切片隨機(jī)選擇5個高倍(×400) 視野，以結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(dá)，按陽性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞的百分比分類，陽性細(xì)胞百分比≥25%判讀為CXCR2表達(dá)陽性切片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)數(shù)資料用率(%)表示，兩組計(jì)數(shù)資料間的比較采用2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCR2在結(jié)腸腺癌及癌旁組織的表達(dá) 87例結(jié)腸腺癌組織中，CXCR2蛋白在癌巢中呈普遍表達(dá)，個別病例呈局灶性分布。高倍鏡下觀察，在結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均有CXCR2蛋白的陽性表達(dá)，在癌細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性顆粒(圖1)。CXCR2 蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)率為66.7%(58/87)，在癌旁組織中的表達(dá)率為14.9%(13/87)。CXCR2 蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(dá)率較癌旁組織顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=48.181，P<0.001)。見表1。

2.2 CXCR2表達(dá)與結(jié)腸腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系 存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸腺癌組織中CXCR2蛋白的表達(dá)率較淋巴結(jié)陰性組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。同時，臨床Ⅲ期的結(jié)腸腺癌組織中CXCR2蛋白的陽性率較臨床Ⅰ～Ⅱ期組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039)。存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期高的結(jié)腸腺癌CXCR2 蛋白表達(dá)顯著增加，而CXCR2 表達(dá)在不同年齡、性別及組織學(xué)分級的分組比較中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

3 討論

趨化因子由一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的小分子肽(8～14 kD)組成，主要是堿性的可溶性肽，CXC型趨化因子是其中重要的一類。CXC表示兩個半胱氨酸殘基在N端附近的位置，X表示任何氨基酸(含半胱氨酸基序)。CXCR2是一個位于細(xì)胞膜上的7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，包括1個N端、1個C端、3個胞外和3個胞質(zhì)環(huán)。CXCR2的N端位于細(xì)胞外，而C端位于細(xì)胞內(nèi)，含有絲氨酸和蘇氨酸殘基，有助于CXCR2的磷酸化、內(nèi)化和螯合過程[12]。當(dāng)CXCR2與相應(yīng)的配體在細(xì)胞外結(jié)合后，構(gòu)象發(fā)生改變，激活細(xì)胞內(nèi)偶聯(lián)的G蛋白，啟動相應(yīng)的信號通路，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)/核因子κB (NF-κB)和蛋白激酶B(PKB/AKT)信號通路等。這些通路與腫瘤細(xì)胞的生存、增殖、血管生成、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等病理過程密切相關(guān)，也與抗癌治療的反應(yīng)性及療效密切相關(guān)[13]。

A： CXCR2在癌旁組織中的表達(dá)(×40); B: CXCR2在癌旁組織中的表達(dá)(×200); C: CXCR2在腺癌組織中的表達(dá)(×40); D: CXCR2在腺癌組織中的表達(dá)(×200)

圖1 CXCR2在結(jié)腸腺癌及癌旁組織中的表達(dá)

表1 CXCR2在結(jié)腸腺癌及癌旁組織中的表達(dá)例(%)

CXCR2是人CXC趨化因子CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7和CXCL8的G蛋白偶聯(lián)受體。最初的研究認(rèn)為，CXCR2的主要免疫功能是調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的遷移，因?yàn)樗刂浦@些細(xì)胞從骨髓組織的遷出，以及它們向炎癥部位的遷入[14]。之后的研究證實(shí)，CXCR2不但是中性粒細(xì)胞遷移的關(guān)鍵介質(zhì)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用。在侵襲性腸腺癌小鼠模型中，降低CXCR2的表達(dá)后皮膚和腸道炎癥性腫瘤的發(fā)生，及自發(fā)性腺癌的形成均受到顯著抑制。同時，抑制CXCR2的功能，也顯著降低了小鼠腸道腫瘤的發(fā)生，表明CXCR2拮抗劑在治療癌癥方面可能具有治療和預(yù)防的潛力[15]。

本研究中，CXCR2 蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)率66.7%(58/87)較癌旁組織14.9%(13/87)顯著升高(P<0.001)。同時，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.006)、臨床分期Ⅲ期(P=0.039)的結(jié)腸腺癌中CXCR2 蛋白表達(dá)，較淋巴結(jié)陰性、臨床Ⅰ～Ⅱ期的顯著增加，提示其與患者預(yù)后不良相關(guān)。當(dāng)前，越來越多的證據(jù)表明，CXCR2在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的作用也十分重要。研究發(fā)現(xiàn)，CXCR2的缺失可以降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能[16]。在鼠乳腺癌模型中，CXCR2信號通路對于吸引骨髓來源抑制細(xì)胞(MDSCs)進(jìn)入腫瘤微環(huán)境起關(guān)鍵作用，后者是驅(qū)動腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要細(xì)胞成分之一[17]。與此同時，轉(zhuǎn)移部位的腫瘤通過表達(dá)CXCR2進(jìn)一步吸引MDSCs向轉(zhuǎn)移灶的遷入，促進(jìn)轉(zhuǎn)移瘤局部微環(huán)境的建立。此外，最新的研究證明，中性粒細(xì)胞在乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移定植過程中發(fā)揮重要作用，而這一過程的實(shí)現(xiàn)有賴于腫瘤細(xì)胞的CXCR2表達(dá)[18]。在小鼠肺癌原位瘤模型中敲除CXCR2能引發(fā)相關(guān)趨化因子的耗竭，并顯著降低了腫瘤的生長速度及腫瘤組織的微血管密度，證實(shí)了CXCR2參與腫瘤進(jìn)展和血管生成[19]。在前列腺癌和胰腺癌中也觀察到類似的結(jié)果，敲除CXCR2的小鼠腫瘤較小，腫瘤血管生成減少[20-21]。有關(guān)CXCR2抑制劑在癌癥臨床治療中的應(yīng)用正處于開發(fā)之中[22]。

本研究證實(shí)了CXCR2 蛋白在結(jié)腸腺癌組織中高表達(dá)，與患者預(yù)后不良相關(guān)。最新的文獻(xiàn)報道，親代結(jié)腸癌細(xì)胞株與其誘導(dǎo)分化的耐藥細(xì)胞株中CXCR2、CXCL1、2、3和IL-8蛋白表達(dá)水平存在顯著差異，耐藥細(xì)胞株的上述蛋白表達(dá)明顯升高。CXCR2與CXCL2特異性結(jié)合后形成CXCL2-CXCR2軸，在促進(jìn)細(xì)胞株耐藥的產(chǎn)生、腫瘤形成、參與血管生成上發(fā)揮重要作用。利用siRNAs方法敲低耐結(jié)腸癌藥細(xì)胞株的CXCR2表達(dá)后，其Gαi2蛋白、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物等均顯著降低，而敲低親代細(xì)胞株的CXCR2表達(dá)后無此現(xiàn)象，證實(shí)了CXCL2-CXCR2軸通過Gαi2蛋白信號發(fā)揮作用[23]。

表2 CXCR2表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 例(%)

本研究結(jié)果提示了靶向CXCR2是治療結(jié)腸癌及預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)的可行方法之一。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌患者中，受體相互作用蛋白激酶3 (Receptor-interacting protein kinase 3, RIP3)表達(dá)顯著降低，而阻斷趨化因子CXCL1-CXCR2軸能為抑制疾病進(jìn)展相關(guān)的免疫治療提供方法。證實(shí)了RIP3缺陷促進(jìn)了CXCL1-CXCR2軸誘導(dǎo)的骨髓源性抑制細(xì)胞MDSCs向腫瘤組織的趨化的積累，進(jìn)而促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的免疫逃逸和疾病進(jìn)展。而CXCR2拮抗劑可顯著抑制RIP3敲除小鼠的MDSC趨化性和HCC生長，為肝癌治療提供了新思路[24]。

此外，骨轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最常見的死亡原因之一，尤其對于發(fā)病率高的肺癌、乳腺癌等[25]。原發(fā)性腫瘤的治療方式相對多，但當(dāng)患者出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移后，其治療選擇很少。新近的研究發(fā)現(xiàn)，CXCR2受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在骨相關(guān)炎癥過程中發(fā)揮重要作用，其配體CXC趨化因子如CXCL6和CXCL8(IL-8)在骨轉(zhuǎn)移過程中促進(jìn)骨吸收。研究者利用CXCR2-/-基因敲除小鼠，向其注射cl66-熒光素酶(Cl66-Luc)或4t1-熒光素酶(4T1-Luc)細(xì)胞，觀察到CXCR2-/-小鼠骨破壞和骨轉(zhuǎn)移減少，驗(yàn)證了CXCR2參與乳腺癌骨溶解和骨轉(zhuǎn)移，為癌癥骨轉(zhuǎn)移提供了新方式[26]。

綜上所述，CXCR2在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要作用。本研究證實(shí)了CXCR2在結(jié)腸腺癌中的廣泛表達(dá)，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅲ期的結(jié)腸腺癌中CXCR2 蛋白表達(dá)顯著增加，提示其與預(yù)后不良相關(guān)。CXCR2不但可作為結(jié)腸腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的檢測指標(biāo)，還可針對CXCR2開發(fā)相應(yīng)的靶向抑制劑，為結(jié)腸癌的治療提供更多方式。