Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤復發(fā)惡性變的相關(guān)分子特點觀察*

孫曉玲， 張曉娟， 張清泉， 邱雷， 王林娜， 侯素平

哈勵遜國際和平醫(yī)院病理科(河北衡水 053000)

Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤是一種呈浸潤性生長的低級別膠質(zhì)瘤。其在星形膠質(zhì)細胞瘤中有較高發(fā)生率[1]。Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤部分會惡性進展，若其發(fā)展為多形性膠質(zhì)母細胞瘤等類型，則會嚴重影響患者生命安全。有研究表明彌漫浸潤性星形膠質(zhì)細胞瘤或者多形性膠質(zhì)母細胞瘤的惡性進展與腫瘤基因分子亞型不同有關(guān)[2]。彌漫浸潤性星形膠質(zhì)細胞瘤后發(fā)生其增殖指數(shù)會發(fā)生一定變化，同時伴有重要功能分子缺失，諸多分子改變的特點均與基因分型密切相關(guān)，星形膠質(zhì)細胞瘤基因分子表達差異對分子靶點藥物研發(fā)有重要意義，是目前臨床重點關(guān)注的課題。因此，本研究通過對收治的57例Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤復發(fā)惡性變標本的相關(guān)分子特點進行回顧性分析，旨在通過基因分子亞型探索為臨床制定Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤復發(fā)惡性變治療方案提供依據(jù)。具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年7月至2018年8月收治的57例Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤患者。根據(jù)臨床進程不同將患者均分為3組(未復發(fā)組、復發(fā)進展組以及復發(fā)無進展組)。57例患者家屬均對本研究知情并簽署知情協(xié)議書，本研究獲得倫理委員會批準。未復發(fā)組患者共有20例，患者年齡42～72歲，平均(55.38±5.36)歲，男14例，女6例。膠質(zhì)瘤進展組共有19例，患者年齡41～73歲，平均(53.28±4.67)歲，男12例，女7例。膠質(zhì)瘤無進展組共有18例，患者年齡41～73歲，平均(55.46±4.82)歲，男10例，女8例。3組患者資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 納入和排除標準 納入標準：(1)均在手術(shù)時經(jīng)過組織學診斷[3]；(2)臨床資料完整具有可溯性；(3)均為非初診病例；(4)首診均為本院；(5)均為本院同一團隊施術(shù)者。其中，未復發(fā)組納入標準：臨床資料顯示患者行手術(shù)切除后醫(yī)院持續(xù)隨訪5年，患者未復發(fā)。膠質(zhì)瘤進展組納入標準：臨床資料顯示腫瘤切除后腫瘤復發(fā)，判斷依據(jù)為影像學檢查、再次手術(shù)發(fā)現(xiàn)于原手術(shù)部位重新長出腫瘤。術(shù)后病理證實腫瘤進展為Ⅲ或Ⅳ級，為惡性病變。復發(fā)無進展組納入標準：術(shù)后病理證實腫瘤進展為Ⅱ級改變。

排除標準：(1)臨床資料不全者；(2)惡性腫瘤者。

1.3 儀器與試劑 CX31光學顯微鏡(購自北京索萊寶科技有限公司)、數(shù)碼相機(上海歌凡生物科技有限公司)。5415 D離心機(購自Gibco公司。EPS-300穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購自上海源葉生物科技有限公司。電子天平(品牌：GB303，產(chǎn)地：美國)。鼠抗人單克隆抗體購自美國Sigma公司。兔抗人單克隆抗體試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司。兔抗人單克隆抗體購自上海研謹生物科技有限公司。生物素標記二抗工作液購自Peprotech公司。分析純二甲苯購自上海研生實業(yè)有限公司。p21、Ki-67、p27測序反應試劑均購自美國BD Biosciences公司。DNA Marker DL 2000由美國Thermo Forma公司提供。

1.4 免疫與組化染色步驟 選取57例Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤切取組織標本作為觀察對象，第一步57例Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤標本中性甲醛溶液脫水固定；第二步為常規(guī)石蠟包埋。下一步為切片、免疫組化染色、10%過氧化氫室溫處理10 min、蒸餾水洗、PBS洗、孵育且之后PBS洗、蘇木素染細胞核。采用SP兩步法進行免疫組化染色(染色強度評分共3分，無著色為0分，低度染色計1分，3分為重度著色；陽性判斷指標以細胞質(zhì)、細胞核著色即顯示為棕色為陽性)。將57例Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤的cDNA與不同稀釋度的p21、Ki-67、TP53定植品按參考文獻[4]的反應體系以及反應條件進行擴增。mRNA 的表達(反向引物為5′-TCAGACACCTTGCAGACCAG-3′；β-actin 作為內(nèi)參照，正向引物為5′-ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3′，反向引物為5′-ATCCTTCTGACCCATGCCCACCA-3′)、構(gòu)建PCR反應體系、分析mRNA相對表達量。標本中的p21、Ki-67、TP53基因的拷貝數(shù)根據(jù)擴增曲線以及標準曲線進行計算。經(jīng)過計算得出p21、Ki-67、TP53單位質(zhì)量的蛋白表達水平。同時對p21、Ki-67、TP53進行基因測序。操作者共有兩位，均有豐富的臨床工作經(jīng)驗，并且對本次研究不知情，為單盲法判斷。

2 結(jié)果

2.1 3組57例Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤標本TP53、p21、Ki-67蛋白質(zhì)分子表達水平對比 復發(fā)進展組的TP53蛋白質(zhì)分子表達水平明顯高于未復發(fā)組、復發(fā)無進展組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。復發(fā)無進展組TP53蛋白質(zhì)分子水平明顯高于未復發(fā)組，對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。復發(fā)進展組p21、Ki-67與未復發(fā)組、復發(fā)無進展組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

組別例數(shù)p21Ki-67TP53未復發(fā)組200.313±0.1470.354±0.1220.415±0.162?△復發(fā)進展組190.342±0.1430.302±0.1260.702±0.131&復發(fā)無進展組180.331±0.1450.321±0.1230.635±0.126?

*與復發(fā)進展組比較P<0.05；△與復發(fā)無進展組比較P<0.05

2.2 57例Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤標本TP53、p21、Ki-67染色強度評分比較 復發(fā)進展組、復發(fā)無進展組TP53染色強度評分明顯高于未復發(fā)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。復發(fā)進展組TP53染色強度評分最高，其余p21、Ki-67各組間對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2、圖1。

表2 3組TP53、p21、Ki-67染色強度評分比較 分

*與復發(fā)無進展組比較P<0.05；△與復發(fā)進展組比較P<0.05

A：Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤(HE); B：復發(fā)后p21(免疫組化)；C：復發(fā)前TP53(免疫組化)；D：復發(fā)后TP53(IHC)

2.3 TP53基因測序情況 在5例組織中發(fā)現(xiàn)6個(共4類)突變，包括外顯子5、7、8三個外顯子(各1例病變)，另外1例同時存在2個突變。所有突變者都是惡性進展組病例。在臨床基因序列測定中有較小的概率可發(fā)現(xiàn)TP53基因突變而TP53未表達的情況。

3 討論

TP53是Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤復發(fā)惡性變的國內(nèi)外重點研究課題，其是一種被臨床較早發(fā)現(xiàn)的細胞生長周期負調(diào)節(jié)因子[5-6]。TP53的核心作用具有調(diào)節(jié)細胞周期、介導損傷后細胞應激反應以及避免細胞癌變復發(fā)惡性變的作用，在避免基因組遺傳穩(wěn)定性受影響發(fā)揮了重要的保護作用，此外TP53在決定細胞是否啟動DNA合成有著不可或缺的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)TP53基因在免疫組化意義上過表達，結(jié)合現(xiàn)有國內(nèi)外前瞻性研究分析其過表達意義，這可能是由于TP53基因突變，其介導的TP53蛋白半衰期較之正常TP53明顯延長，繼而導致TP53蛋白半衰期蓄積、免疫組織化學過表達[7-8]。臨床上針對膠質(zhì)瘤與TP53基因相關(guān)性的研究探討較少，本次研究基于國外關(guān)于TP53基因的研究進行實驗方案設計，論證了膠質(zhì)瘤與TP53基因的相關(guān)性。

本次研究結(jié)果表明復發(fā)進展組、復發(fā)無進展組TP53染色強度評分明顯高于未復發(fā)組， 復發(fā)進展組TP53染色強度評分最高，其余p21、Ki-67各組間對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這是因為TP53蛋白抗體不能準確識別野生型TP53與突變型TP53，Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤復發(fā)惡性變過程中TP53基因突變、TP53蛋白過表達多為同時發(fā)生，在此過程中突變型TP53喪失了維持基因組穩(wěn)定性以及降低基因突變率等作用[9]。常方圓等[10]在研究中針對惡性外周神經(jīng)鞘膜瘤組織標本63例進行樣本基因組異常情況檢測，結(jié)果表明63例惡性外周神經(jīng)鞘膜瘤組織樣本中TP53的高表達率分別為30.2%(19/63)，此研究結(jié)果提示TP53基因突變后功能失活使其監(jiān)視細胞分裂、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及減慢細胞分裂等作用均發(fā)生了變化，TP53的高表達率在惡性外周神經(jīng)鞘膜瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。結(jié)合上述研究結(jié)果分析TP53在Ⅱ級星形膠質(zhì)瘤中的作用：在正常狀況下TP53野生型可起到抑制Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤復發(fā)惡性變的作用，并通過監(jiān)視作用DNA受到損傷或發(fā)生變異時促使其自我修復，而在缺乏TP53野生型的表達情況下，DNA損傷修復不能終止在G1期，其是Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤復發(fā)惡性變的重要基礎(chǔ)之一，這也是復發(fā)進展組TP53染色強度評分最高的原因[11-12]。

本次研究結(jié)果表明在5例組織中發(fā)現(xiàn)6個(共4類)突變，包括外顯子5、7、8三個外顯子(各1例病變)，另外1例同時存在2個突變，這提示所有突變者都是惡性進展組病例TP53在自身結(jié)構(gòu)上具有一定特點，如第5、7、8三個外顯子的復等位基因呈現(xiàn)多態(tài)性，野生型TP53在5、7、8三個外顯子發(fā)生突變后轉(zhuǎn)化為突變型TP53基因，其是Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤復發(fā)惡性變的重要分子特點之一。并且突變型TP53基因的種類較多，具有癌基因的作用，喪失了負調(diào)節(jié)作用等，突變型TP53基因后可促進Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)化以及惡性病變[13-14]。Fan等[15]在研究中表明Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤的發(fā)展過程中TP53發(fā)生等位基因丟失，蛋白過度表達等情況，意味著突變型TP53癌基因與Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤的復發(fā)與進展有著密切關(guān)聯(lián)，這與本次研究結(jié)果較為一致。近年來臨床針對TP53基因的研究較多，如董雯等[16]在研究中針對星形膠質(zhì)細胞活化過程中的信號通路進行分析，小鼠星形膠質(zhì)細胞基因表達譜芯片檢查結(jié)果提示p53信號通路在腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細胞活化過程中具有重要作用，與本次研究認為p53信號通路介導Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤病變的觀點一致。此外目前臨床研究已經(jīng)證實TP53基因突變與人乳頭瘤病毒感染有著明顯關(guān)聯(lián)，對促進宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展有著重要作用，研究結(jié)果提示腫瘤抑制基因p53基因外顯子突變后會喪失原有的抑癌作用，其是TP53基因突變后參與Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤病變的有力佐證[17]。此外諸多臨床研究表明NF-κB及ERK1/2酶介導的p53等編碼基因在腫瘤發(fā)生與發(fā)展時起到了重要作用，腫瘤細胞增殖也主要是通過p53信號通路來完成，當p53尚未突變時其可阻止腫瘤細胞G0期進展至G1期，而隨著p53基因突變，其喪失了監(jiān)控腫瘤細胞增殖的作用，因此在腫瘤細胞G1期時外周血內(nèi)p53陽性率明顯上升，其提示Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤進展及復發(fā)與p53陽性率上升有著密不可分的關(guān)聯(lián)[18-19]。

有待進一步研究的問題：Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤復發(fā)惡性變的分子特點對指導臨床開展靶向治療有積極意義，TP53基因突變的研究有待進一步深入[20]。由于本研究未采用大樣本數(shù)據(jù)進行實驗探索，未能深入探究Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤復發(fā)惡性變的分子特點與Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤復發(fā)的相關(guān)性，使得本次研究結(jié)果有一定局限性，突變型TP53基因促進Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤細胞增殖的作用機制有待進一步探究。

綜上所述，Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤復發(fā)惡性變的分子特點包括TP53基因突變、蛋白質(zhì)分子過表達，TP53基因突變對提示Ⅱ級星形膠質(zhì)細胞瘤復發(fā)與進展具有重要的預示作用，值得臨床重點關(guān)注。