大黃蟄蟲膠囊聯(lián)合恩替卡韋對乙肝肝硬化患者肝纖維化及T細(xì)胞亞群的影響

姚仲彩, 蔡亞軍, 石勇明, 高東凱

諸暨市人民醫(yī)院 1感染科， 2藥劑科(浙江紹興 311810)

慢性乙型肝炎(chronic viral hepatitis B，CHB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染產(chǎn)生的傳染性疾病，全球2.4億CHB患者，約 65 萬人死于HBV肝硬化和肝細(xì)胞癌等嚴(yán)重疾病[1]。肝纖維化是CHB發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)過程，積極開展抗病毒及抗纖維化治療，早期肝硬化仍可能逆轉(zhuǎn)。目前臨床上首選恩替卡韋進(jìn)行HBV治療，其主要藥理機(jī)制與HBV多聚酶的三磷酸脫氧鳥嘌呤核苷競爭，抑制HBV多聚酶啟動，有效地阻礙病毒復(fù)制[2]。但恩替卡韋長期應(yīng)用效果不佳，陳娟娟等[3]研究發(fā)現(xiàn)，恩替卡韋治療后HBV得到快速有效控制，但短期肝纖維化改善尚不明顯[3]。隨著中醫(yī)藥治療肝硬化研究的深入，其通過抗炎護(hù)肝、清除自由基、抗氧化等作用，促進(jìn)肝病轉(zhuǎn)歸[4-5]。其中，大黃蟄蟲膠囊具有抗肝纖維化、活血祛瘀、通經(jīng)消癥等作用[6]，但目前就大黃蟄蟲膠囊聯(lián)合恩替卡韋治療CHB肝硬化鮮有報道?；诖耍以翰扇≡撀?lián)合用藥，分析治療前后肝功能及肝纖維化等水平，觀察臨床療效，探討其對肝纖維化及T細(xì)胞亞群的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年11月至2018年11月我院住院及門診收治的CHB肝硬化患者64例，其中，男36 例，女28例，年齡(50.44±4.59)歲。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將64例CHB肝硬化患者分為對照組32例和觀察組32例，比較兩組性別、年齡、天門氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及總膽紅素(total bilirubin，TBil)，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015 年版)》[7]乙肝及乙型肝炎肝硬化的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)符合《肝硬化中西醫(yī)結(jié)合診療共識》[8]中肝硬化瘀血阻絡(luò)證的中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)：兩脅下刺痛，痛處固定，夜間尤甚；脅下可捫及包塊；腹部堅(jiān)滿，質(zhì)硬不能凹陷；腹壁青筋暴露；唇色紫褐；舌質(zhì)紫暗，有瘀斑或瘀點(diǎn)等；(3)患者既往從未接受過類似的抗病毒藥物及抗肝纖維化治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠期哺乳期婦女；(2)其他原因性肝病；(3)合并心腎等重大臟器病變或惡性腫瘤患者。本研究由我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批且批準(zhǔn)，患者及其家屬了解并簽署知情同意書。

1.2 方法 對照組接受恩替卡韋分散片(江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司；國藥準(zhǔn)字H20100019；生產(chǎn)批號：170604；規(guī)格：0.5 mg/片)，清晨空腹服用，劑量為1片/次，1次/d。在對照組基礎(chǔ)上，觀察組患者加用大黃蟄蟲膠囊(江蘇頤海藥業(yè)有限責(zé)任公司；國藥準(zhǔn)字Z20054026；生產(chǎn)批號：170905；規(guī)格：0.4 g/粒)口服治療，4粒/次，2次/d，兩組患者均連續(xù)治療24周。

1.3 觀察指標(biāo) (1)肝功能水平比較：兩組研究對象治療前后分別于抽取空腹外周靜脈血5 mL，置于肝素鈉采血管中，靜置30 min，以轉(zhuǎn)速3 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，收集上清液，-40℃低溫下保存待測，采用羅氏P-800 全自動生化儀測定AST、ALT及TBil水平。(2)比較兩組治療前后肝纖維化指標(biāo)：采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測肝纖維化血清標(biāo)志物透明質(zhì)酸(hyaluronic acid， HA)、層粘連蛋白(laminin，LN)、Ⅳ型膠原(collage typeⅣ,Ⅳ-Co)及Ⅲ型前膠原(procollagen-Ⅲ，PCⅢ)，試劑盒由上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司提供，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。(3)比較兩組治療前后影像學(xué)指標(biāo)：采用瞬時彈性成像測定患者肝硬度數(shù)值，每次檢查同人同機(jī)，檢測部位為右側(cè)腋前線至腋中線第7、8、9肋間，同一測定部位獲取 10 個有效值，取中位數(shù)作為檢查結(jié)果，檢測儀器為Echosens公司生產(chǎn)的瞬時彈性波掃描儀；使用腹部彩色多普勒B超檢測肝門靜脈內(nèi)徑和脾臟厚度，儀器為Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH公司西門子ACUSON S2000全數(shù)字彩色多普勒超聲儀。(4)比較兩組治療前后T細(xì)胞亞群表達(dá)：采用流式細(xì)胞法檢測CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平，檢測儀器為美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的CytoFLEX LX 流式細(xì)胞儀，檢測試劑由上海恒信化學(xué)公司提供，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。(5)比較兩組治療前后HBV-DNA載量：同期抽取外周靜脈血5 mL，靜置30 min，轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心5 min，棄上清，采用多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)測定HBV-DNA，按下列條件擴(kuò)增：93℃ 5 min預(yù)變性，然后按93℃45 s-55℃120 s, 共做40個循環(huán)。試劑盒為中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心產(chǎn)品，檢測儀器為美國Perkin Elmer 公司PE 7700自動熒光PCR儀。(6)比較兩組治療前后總有效率。

1.4 療效評估 臨床療效判斷標(biāo)準(zhǔn):結(jié)合《肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南》及《肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見》(2017年版)[9]對乙肝肝硬化代償期總體療效判斷標(biāo)準(zhǔn)：(1) 顯效: 癥狀和影像學(xué)指標(biāo)基本消失，肝功能顯著改善，指標(biāo)降低>50%，肝纖維指標(biāo)中有 2 項(xiàng)檢測值下降>40%,HBV-DNA 陰轉(zhuǎn)； (2) 有效: 癥狀、體征改善，肝功能好轉(zhuǎn)，指標(biāo)降低>50%，肝纖維指標(biāo)中有2項(xiàng)檢測值降低30%～40%,HBV-DNA降低>2個log；(3)無效:癥狀、體征無變化，肝功能、肝纖維化指標(biāo)和HBV-DNA無明顯變化甚至加重?？傆行?%)=(顯效+有效)/總例數(shù)×100。

2 結(jié)果

2.1 兩組肝功能水平比較 治療前，觀察組與對照組AST、ALT、TBil、HBV-DNA載量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，兩組肝功能指標(biāo)較治療前出現(xiàn)下降(P<0.05)，同時，觀察組AST、ALT、TBil、HBV-DNA載量明顯低于對照組(P<0.05)。見表2。

項(xiàng)目例數(shù)AST(U/L)ALT(U/L)治療前治療后治療前治療后觀察組3269.61±12.2733.57±5.70?88.90±20.0238.38±8.44?對照組3267.27±15.6839.41±8.20?81.68±20.5643.75±9.97?t值0.666-2.5151.423-2.324P值0.5080.0150.1600.023項(xiàng)目例數(shù)TBil(μmol/L)HBV-DNA載量(log)治療前治療后治療前治療后觀察組3233.90±7.4218.25±2.98?6.73±1.513.74±0.67?對照組3236.07±6.3521.09±3.45?6.49±1.234.59±0.97?t值-1.255-3.5150.725-4.058P值0.2140.0010.4710.000

*與同組治療前比較P<0.05

2.2 兩組肝纖維化指標(biāo)比較 治療前，兩組患者HA、LN、Ⅳ-Co、PCⅢ比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與治療前比較，兩組肝纖維化水平均出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)，同時觀察組均顯著低于對照組(P<0.05)。見表3。

項(xiàng)目例數(shù)HA(μg/L)LN(μg/L)治療前治療后治療前治療后觀察組32183.60±64.70124.91±35.99?201.67±56.27145.78±38.04?對照組32186.62±50.19160.12±39.64?230.00±67.20181.35±47.65?t值-0.209-3.721-1.853-3.300P值0.8350.0000.0690.002項(xiàng)目例數(shù)Ⅳ-Co(μg/L)PCⅢ(μg/L)治療前治療后治療前治療后觀察組32177.41±63.2597.93±35.95?204.39±60.63113.89±20.39?對照組32161.72±61.34124.88±35.14?197.27±58.43143.50±29.61?t值1.005-3.0330.479-4.658P值0.3190.0040.6340.000

*與同組治療前比較P<0.05

2.3 兩組影像學(xué)指標(biāo)比較 治療后，兩組患者肝門靜脈內(nèi)徑、脾臟厚度、肝臟硬度數(shù)值顯著降低，同組治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療后觀察組肝門靜脈內(nèi)徑、脾臟厚度、肝臟硬度數(shù)值低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

項(xiàng)目例數(shù)肝門靜脈內(nèi)徑(mm)脾臟厚度(mm)肝臟硬度數(shù)值(kPa)治療前治療后治療前治療后治療前治療后觀察組3214.99±0.3813.02±0.39?44.94±0.8140.01±0.57?20.99±0.1713.93±0.32?對照組3214.96±0.3313.51±0.41?45.10±0.9441.04±0.51?20.43±0.1917.94±0.25?t值0.339-4.839-0.758-7.635-0.229-56.263P值0.7360.0000.4510.0000.8190.000

*與同組治療前比較P<0.05

2.4 兩組T細(xì)胞亞群表達(dá)比較 治療前，觀察組與對照組T細(xì)胞亞群差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，兩組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+數(shù)值顯著上升，CD8+水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，觀察組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平高于對照組，CD8+低于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

項(xiàng)目例數(shù)CD3+(%)CD4+(%)治療前治療后治療前治療后治療前治療后治療前治療后觀察組3253.10±6.8669.94±5.87?31.53±2.7238.58±2.76?對照組3250.98±5.4559.82±6.83?30.66±3.3832.81±2.82?t值1.3636.3601.1348.262P值0.1780.0000.2610.000項(xiàng)目例數(shù)CD8+(%)CD4+ /CD8+治療前治療后治療前治療后觀察組3236.14±4.1329.58±3.30?1.03±0.251.47±0.15?對照組3235.50±3.5531.68±3.00?1.04±0.261.32±0.16?t值0.655-2.657-0.1094.232P值0.5150.0100.9140.000

*與同組治療前比較P<0.05

2.5 兩組臨床總有效率比較 觀察組顯效15例，有效12例，總有效率為84.4%，高于對照組顯效10例，有效9例，總有效率62.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 兩組臨床總有效率比較 例(%)

3 討論

目前，HBV感染呈世界性流行，我國為高流行區(qū)，HBV感染者約9 300萬人，其中CHB患者約2 000萬例，且發(fā)病率逐年升高[10]。慢性感染HBV時，特異性T淋巴細(xì)胞易凋亡，分泌細(xì)胞因子功能和增殖能力顯著降低，T淋巴細(xì)胞功能耗竭，HBV持續(xù)復(fù)制，炎癥因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)反復(fù)發(fā)生，再生及結(jié)締組織增生，進(jìn)而形成纖維隔，逐步進(jìn)展為肝纖維化和肝硬化[11]。CHB患者肝硬化年發(fā)生率為2%～10%，失代償性肝硬化5年生存率僅為14%～35%[7]，因此，應(yīng)盡早抑制HBV復(fù)制，改善肝細(xì)胞病理損傷及肝纖維化，提高患者生活質(zhì)量，延長生存時間?！堵砸倚透窝追乐沃改稀?2015年版)》中推薦起始治療優(yōu)先使用恩替卡韋，恩替卡韋是一種脫氧鳥嘌呤核苷酸類似物，與 HBV 逆轉(zhuǎn)錄的自然底物dGTP競爭結(jié)合相同位點(diǎn)，選擇性地抑制HBV的逆轉(zhuǎn)錄酶。國內(nèi)外臨床研究顯示，該藥物有效緩解肝組織病變，改善肝纖維化，逆轉(zhuǎn)肝硬化[12-13]，隨訪研究表明，24 周HBeAg陽性轉(zhuǎn)陰率為56.25%，48周轉(zhuǎn)陰率為79.17%；HBV-DNA 載量由6.2下降至3.1 log copies/mL[14]。但部分患者服藥后出現(xiàn)疲勞、頭暈、頭痛、嘔吐等癥狀，長期服藥有引發(fā)乳酸酸中毒的風(fēng)險[15]，故常需要聯(lián)合其他藥物以提高整體療效。

近年來，在中醫(yī)辨證治療的基礎(chǔ)上，中藥及中成藥針對病因病機(jī)，四診合參，已形成肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見，中醫(yī)藥結(jié)合恩替卡韋治療CHB療效顯著，能改善肝功能并阻止纖維化進(jìn)程，一定程度上逆轉(zhuǎn)肝硬化[16]。王志煒等[17]研究疏肝健脾活血方聯(lián)合恩替卡韋指標(biāo)肝硬化，治療后總有效率為 89.47%高于對照組71.05%，觀察組 HBV-DNA由5.92下降為1.93 log10copies/mL[17]。中醫(yī)認(rèn)為，肝硬化屬“脅痛”、“黃疸”、“積聚”、“鼓脹”、“肝積”等范疇，內(nèi)因是外邪入侵，外因是濕熱疫毒，病機(jī)以“瘀血阻絡(luò)，經(jīng)脈閉阻”多見，應(yīng)治以“活血化瘀，通經(jīng)消癥”為法。本研究所用藥為大黃蟄蟲膠囊，其是有《金匱要略》名方“五勞虛極，羸瘦腹?jié)M，不能飲食……內(nèi)有干血，肌膚甲錯，兩目黯黑，緩中補(bǔ)虛，大黃蟲丸主之”化裁而來，含草木藥(熟大黃、黃芩、地黃、干漆、苦杏仁、桃仁、白芍、甘草)及蟲類藥(蟄蟲、虻蟲、水蛭、蠐螬)，具有活血散瘀、通經(jīng)散結(jié)、升降氣機(jī)、柔肝止痛、通經(jīng)消癥之效。本研究結(jié)果顯示，觀察組臨床療效(84.4%)明顯高于對照組(62.5%)，而經(jīng)治療后，肝功能指標(biāo)及肝纖維化水平則明顯低于對照組，證實(shí)聯(lián)合恩替卡韋給藥能促進(jìn)肝功能復(fù)常，改善肝纖維化，對CHB患者治療有積極協(xié)同作用。這與石俊、楊波等[18-19]研究結(jié)論一致，其研究顯示，聯(lián)合服用恩替卡韋分散片和大黃蟅蟲丸患者有效率為92.41%高于單服恩替卡韋分散片患者69.23%，且ALT、AST及TBil等指標(biāo)下降幅度高于單獨(dú)服藥組。這可能與大黃蟄蟲膠囊抑制肝星狀細(xì)胞中 p38MAPK信號通路，阻礙磷酸化 p38MAPK 表達(dá)，減少肝星狀細(xì)胞形成，起到抗肝纖維化作用有關(guān)[20]。大黃蟄蟲膠囊成分大黃具有調(diào)節(jié)免疫力、消除自由基、抗肝纖維化等作用，通過抑制 CCL4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞 Smad3 mRNA、PDGF-B、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1) 表達(dá)，實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)肝纖維化的作用[21]；水蛭具有抗炎、抗肝纖維化及抑制細(xì)胞凋亡等作用，抑制肝臟結(jié)締組織生長因子mRNA 表達(dá)，從而加強(qiáng)整體抗肝纖維化效果；桃仁具有保護(hù)肝腎、調(diào)節(jié)免疫、營養(yǎng)神經(jīng)等作用，通過抑制Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型膠原的合成，促進(jìn)纖維連接蛋白的降解，以實(shí)現(xiàn)肝纖維逆轉(zhuǎn)。

HBV不直接損傷肝細(xì)胞，其通過誘發(fā)免疫應(yīng)答失調(diào)，導(dǎo)致炎癥反復(fù)發(fā)生及肝細(xì)胞損傷。細(xì)胞免疫在免疫應(yīng)答中起著決定性作用，臨床上通過T細(xì)胞亞群檢測指標(biāo)反映免疫狀況，CD3+參與T淋巴細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；CD4+表達(dá)于輔助T細(xì)胞，識別抗原的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，當(dāng)存在感染和炎癥時，介導(dǎo)前炎癥反應(yīng)；CD8+屬于細(xì)胞毒性T細(xì)胞，對被病毒感染的特異性抗原細(xì)胞具有直接殺傷作用；CD4/CD8比值可有效反應(yīng)細(xì)胞免疫功能水平。且研究顯示，CHB肝硬化患者T 細(xì)胞亞群失調(diào)，CD3+、CD4+、CD4/CD8比值降低，CD8+下降，增加 B淋巴細(xì)胞的分泌, 使體液免疫亢進(jìn),在補(bǔ)體激活的情況下，出現(xiàn)免疫復(fù)合物黏附和沉積現(xiàn)象, 導(dǎo)致肝細(xì)胞病理性改變，從而使肝功能受損[22]。張小玉等[23]研究證實(shí)恩替卡韋能提高外周血淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+和CD8+比例，改善機(jī)體部分免疫功能，但大黃蟄蟲膠囊聯(lián)合恩替卡韋治療對CHB患者T細(xì)胞亞群影響尚無相關(guān)報道。本研究結(jié)果顯示，大黃蟄蟲膠囊聯(lián)合恩替卡韋治療后，CD3+由53.10%上升為69.94%，CD4+水平由31.53%上升為38.58%，CD4/CD8比值由1.03上升為1.47，均明顯高于恩替卡韋單獨(dú)用藥，且HBV-DNA載量由6.73降低為3.74log copies /mL，低于對照組，表明大黃蟄蟲膠囊可增強(qiáng)恩替卡韋改善機(jī)體免疫效能，有效調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群平衡狀態(tài)，改善機(jī)體免疫應(yīng)答功能。本研究樣本量較少，臨床應(yīng)用和推廣仍有一定局限性，下一步研究將開展大樣本多中心研究，探索大黃蟄蟲膠囊聯(lián)合恩替卡韋不同在HBV-DNA載量水平的療效。

綜上所述，大黃蟄蟲膠囊聯(lián)合恩替卡韋用藥治療CHB肝硬化患者療效顯著，可降低HBV-DNA載量，促進(jìn)肝功能復(fù)常，改善肝纖維化，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群，提高機(jī)體免疫狀態(tài)。