一株雞源新城疫病毒的分離鑒定

王 昊，孫德君

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150000）

新城疫病毒屬于副黏病毒科、副黏病毒屬中的一個(gè)種。該病毒主要危害雞和火雞，在被侵襲的雞群中迅速傳播，強(qiáng)毒株可使雞群全群毀滅。弱毒株僅引起雞群呼吸道感染和產(chǎn)蛋量下降。該病毒是一種有囊膜的單股、負(fù)鏈RNA 病毒。病毒粒子具多形性，一般呈近似球形，直徑100～300 nm，有時(shí)也可呈長(zhǎng)絲狀[1-3]。包膜為雙層結(jié)構(gòu)膜，由宿主細(xì)胞外膜的脂類(lèi)與病毒糖蛋白結(jié)合衍生而來(lái)。包膜表面有長(zhǎng)12～15 nm 的刺突，具有血凝素、神經(jīng)氨酸酶。病毒的中心是蛋白質(zhì)衣殼粒，纏繞成螺旋對(duì)稱(chēng)的核衣殼，直徑約18 nm。成熟的病毒是以出芽方式釋放至細(xì)胞外。其對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，55 ℃作用45 min 和直射陽(yáng)光下作用30 min 才被滅活。病毒可在4 ℃中存放幾周，在-20 ℃中存放幾個(gè)月或在-70 ℃中存放幾年，其感染力均不受影響。在新城疫暴發(fā)后8 周之內(nèi)，仍可在雞舍、蛋巢、蛋殼和羽毛中分離到病毒[4-5]。新城疫病毒對(duì)乙醚、氯仿敏感。大多數(shù)常用消毒劑能將其迅速滅活。氫氧化鈉等堿性物質(zhì)對(duì)其消毒效果不穩(wěn)定。來(lái)蘇爾3%～5%、酚和甲酚5 min內(nèi)可將裸露的病毒粒子滅活。在37 ℃的孵卵器內(nèi)，用0.1%福爾馬林熏蒸6 h即可將其滅活。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料

病料采自湖北某養(yǎng)殖廠病死雞的肝臟、肺臟、脾臟。

1.1.2 病毒及血清

雞新城疫病毒La Sota 株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清（H5、H9），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 雞胚

10日齡SPF雞胚，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司提供。

1.1.4 紅細(xì)胞

健康雞紅細(xì)胞，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司質(zhì)量管理部提供。

1.1.5 主要試劑

提取核酸試劑盒，TaKaRa MiniBEST Viral RNA∕DNA Extraction Kit Ver 5.0。

1.1.6 主要試驗(yàn)器材

脈動(dòng)真空滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司，XG1.1型）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DGX-9623BC-1 型）；數(shù)顯電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，HPX-9162 MBE 型）；PCR 儀（美國(guó)BIO-RAD公司，S1000型）；ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD 公司，ChemiDoc RAD 型）；生物潔凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，BCM-1300A型）；冷凍高速離心機(jī)（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，Lengend Micro 21R）；電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，AL204-IC型）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病料處理

取出病死雞的肝臟、肺臟和脾臟，放入滅菌容器中，加入PBS 液10 mL 進(jìn)行研磨，然后放入-20 ℃反復(fù)凍融3次，3 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，加青霉素、鏈霉素使其濃度為1 000 U·mL-1，4 ℃過(guò)夜后置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雞胚的接種傳代

取10 日齡雞胚5 枚，用1 mL 注射器吸取處理好的病毒上清液，尿囊腔接種雞胚（0.2 mL·胚-1），37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)120 h，24 h 進(jìn)行照胚，將24 h內(nèi)的死亡雞胚棄去，收集48～120 h內(nèi)死亡的雞胚，觀察病變，同時(shí)無(wú)菌收集尿囊液，雜檢后放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照以上方法連續(xù)傳3代，收集第3代的尿囊液進(jìn)行鑒定。

1.2.3 血凝抑制實(shí)驗(yàn)

按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（微量法），測(cè)定無(wú)菌收集尿囊液的血凝價(jià)，再用NDV 陽(yáng)性血清和AIV（H5、H9）陽(yáng)性血清進(jìn)行血凝抑制實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 血清中和實(shí)驗(yàn)

將分離株的雞胚尿囊液分別用滅菌生理鹽水稀釋1 000 倍，各取1 mL 病毒稀釋液分別與等量10 倍稀釋的新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和AIV 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清充分混勻后于37 ℃作用1 h，同時(shí)設(shè)置上述滅菌生理鹽水稀釋1 000 倍尿囊液作為對(duì)照組，每組接種10 日齡SPF 雞胚5 只，每胚接種0.1 mL，37 ℃孵育，接種后每天照蛋2 次，觀察120 h。死胚隨時(shí)取出，置4 ℃冰箱。測(cè)定所有雞胚尿囊液的血凝價(jià)。

1.2.5 分離病毒EID50測(cè)定

將第3代病毒尿囊液做10倍系列稀釋?zhuān)?0-6、10-7、10-8 3個(gè)稀釋度，各尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0.1 mL，置37 ℃繼續(xù)孵育。棄去24 h 死亡的雞胚，接種48～120 h 死亡的雞胚隨時(shí)取出，至120 h，取出所有活胚，逐枚收獲雞胚液，分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)≥1：128 者判為感染，按Reed-Muench法計(jì)算EID50[6]。

1.2.6 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank 上已發(fā)表的NDV 的F 基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物，用于擴(kuò)增F基因重要功能區(qū)序列，其中上游引物F1：5'-TGTA GTAACGGGAGACAAAGCAG-3'；下游引物F2：5'-GAATAAATACCAGGAGACATAGGGA-3'。預(yù)計(jì)擴(kuò)增出350 bp的F基因序列。引物交吉林庫(kù)美生物科技有限公司合成，合成的引物用1 mL·L-1DEPC（焦碳酸二乙酯）處理水稀釋至終濃度為20 μmol·L-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 病毒RNA的提取及PCR檢測(cè)

參考TaKaRa MiniBEST Viral RNA∕DNA Extraction Kit 說(shuō)明書(shū)對(duì)雞胚尿囊液進(jìn)行病毒基因組RNA的提取，其具體步驟如下：取200 μL 病毒原液，加入200μL的Buffer VGB，20μL的Proteinase K和1μL 的Carrier RNB，充分混合均勻56 混水浴溫浴10 min。然后向裂解液中加入200μL無(wú)水乙醇，充分吸打均勻。將Spin Column 安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12 000 r·min-1離心2 min，棄濾液。將500μL 的buffer RWA 加入至Spin Column 中，12 000 r · min-1離心1 min，棄濾液。將700μL 的buffer RWB 加入至Spin Column中12 000 r·min-1離心1 min，棄濾液。重復(fù)操作該步驟1次。將Spin Column安置于collection Tube上，12 000 r · min-1離心2 min。將Spin Column 安置于新的1.5 mL RNase free collection tube 上，在Spin Column膜的中央加入35 mL的RNase free dH2O，室溫靜置5 min。12 000 r·min-1離心2 min 洗脫病毒RNA。將下液重新加入到Spin Column 膜的中央，室溫靜置2 min 后，12 000 r·min-1離心2 min 洗脫病毒RNA。

按照Easy Script First-Stand cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，其具體步驟如下：取14.5μL上述提取所得的RNA，加入2μL 的Oligo（隨機(jī)引物），充分混勻于70 ℃水浴5 min，然后置于-20 ℃反應(yīng)5 min。像上述反應(yīng)液中加入5 μL 的5×Buffer、2 μL 的dNTP、0.5μL的RNAi和1μL的mLV，充分混勻于37 ℃水浴1 h。將上述反應(yīng)液于95 ℃水浴5 min，終止反應(yīng)，獲得cDNA。

以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：

F 片段反應(yīng)程序：混勻后，稍微離心，95 ℃5 min，預(yù)變性后，進(jìn)行下列循環(huán)反應(yīng)。

94 ℃ 50 s 變性

49 ℃ 50 s 退火

72 ℃ 1 min 延伸

35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。

1.2.8 凝膠電泳

PCR 產(chǎn)物用15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（將配置好的15 g · L-1瓊脂糖凝膠，熔化后倒入已封好、插入樣品梳的電泳槽中，冷卻凝固后拔出樣品梳，用微量移液器取所得PCR 產(chǎn)物10μL 于15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，條件為100 V、0.02 mA，電 泳15 min，觀察所擴(kuò)增片段）。將瓊脂糖溶液（15 g·L-1）倒入制膠模中，然后在適當(dāng)位置處插上梳子。凝膠厚度一般為3～5 mm。倒入30 mL 瓊脂糖 溶液。

在室溫下使膠凝固，約30 min。取適量PCR產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混勻用微量移液槍小心加入樣品槽中。上樣量根據(jù)樣品濃度可適當(dāng)調(diào)整， 若DNA 含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過(guò)樣品槽容量（一般小孔40μL 為上限，大孔200 μL 為上限，具體和制膠膜規(guī)格 相關(guān)）。每加完一個(gè)樣品要更換槍頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。加完樣后，合上電泳 槽蓋，立即接通電源。控制電壓保持在110 V， 電流＞40 mA。當(dāng)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2 cm 時(shí)（約40 min），停止電泳。紫外光下拍照并觀察。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 病毒的分離

接種的雞胚在48～96 h 有死亡雞胚，解剖后發(fā)現(xiàn)死亡雞胚和正常雞胚相比發(fā)育較小，整個(gè)胚體充血，在頭、頸、腹、背、翅和趾部有出血點(diǎn)，尤其頸部非常明顯。

2.2 血凝和血凝抑制結(jié)果

該毒株具有血凝性，血凝效價(jià)為7～8。病毒株的血凝性可被NDV 的陽(yáng)性血清所抑制，但不能被禽流感病毒的陽(yáng)性血清所抑制從而可以判定分離的毒株為NDV毒株。

2.3 分離毒的EID50結(jié)果

分離毒的EID50結(jié)果為107.83·0.1 mL-1。

2.4 病毒PCR鑒定結(jié)果

用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果分離毒株在約350 bp 處均可見(jiàn)到清晰的目的條帶，見(jiàn)附圖，與預(yù)期結(jié)果相符。

附圖 HB1910株P(guān)CR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

本試驗(yàn)在發(fā)病雞群中分離到一株病毒，能與雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，可被新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清所抑制，不能被禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清所抑制，從而判定該病毒為雞新城疫病毒。本試驗(yàn)為發(fā)病雞場(chǎng)更準(zhǔn)確的找到了雞群發(fā)病的原因，可針對(duì)此原因制定綜合防治措施。

新城疫的防治主要通過(guò)疫苗免疫接種，制定科學(xué)合理的免疫程序?qū)π鲁且叩姆揽刂陵P(guān)重要。免疫雞群也可以發(fā)生新城疫病毒感染，往往由于母源抗體干擾免疫效果導(dǎo)致免疫失敗。因此，新城疫疫苗免疫要掌握好免疫時(shí)機(jī)，避開(kāi)母源抗體高峰期，一般可以對(duì)雞群的母源抗體效價(jià)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，如果抗體效價(jià)高于25則不產(chǎn)生免疫應(yīng)答，在23的時(shí)候免疫接種可以產(chǎn)生良好的免疫效果。

新城疫病毒是家禽最常見(jiàn)的病毒性傳染病，各種家禽普遍易感，各種年齡雞都可感染，幼雞和雛雞更易感。本病春秋兩季高發(fā)，雞群一旦發(fā)生強(qiáng)毒感染，一般很難凈化。平時(shí)需要做好養(yǎng)殖場(chǎng)的環(huán)境衛(wèi)生，保持雞舍的溫度，通風(fēng)良好，一旦發(fā)生患病雞要及時(shí)隔離。此外，防治新城疫要采取嚴(yán)格的生物安全措施，加強(qiáng)引種方面的監(jiān)管，防止新城疫強(qiáng)毒進(jìn)入家禽群，做好定期的免疫接種工作，提高禽群特異性免疫效果。