擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對(duì)玉米種子發(fā)芽及幼苗生長的影響

劉春元 邢小萍 韓衛(wèi)麗

摘要 為建立玉米雜交種和自交系利用擬輪枝鐮孢菌毒素抗性篩選的試驗(yàn)方法，制備擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液，測定不同稀釋倍數(shù)毒素粗提液對(duì)2個(gè)玉米雜交種和4個(gè)玉米自交系處理4 和6 d后的種子發(fā)芽抑制率、胚根生長抑制率以及幼苗致萎效果，分析不同抗性玉米種質(zhì)、毒素稀釋倍數(shù)和處理時(shí)間對(duì)玉米種子發(fā)芽、胚根和幼苗生長的影響。結(jié)果表明，易感雜交種豫玉22與抗性雜交種農(nóng)大108的種子發(fā)芽抑制率和胚根生長抑制率均存在極顯著差異（P<0.01）;在處理后4、6 d時(shí)，前者的種子發(fā)芽抑制率、胚根生長抑制率分別比后者高7.2%、11.3%、12.7%、11.8%。在對(duì)玉米雜交種幼苗致萎蔫試驗(yàn)中，用稀釋2倍和5倍的毒素粗提液處理，豫玉22與農(nóng)大108雜交種幼苗間的萎蔫程度也存在顯著差異（P<0.05）。擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對(duì)不同抗性玉米種質(zhì)種子發(fā)芽、幼苗生長的影響存在顯著差異，為利用擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對(duì)玉米品種進(jìn)行苗枯病抗性鑒定和篩選提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 玉米苗枯病;擬輪枝鐮孢菌;毒素粗提液;發(fā)芽率;胚根生長

中圖分類號(hào) S432.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）19-0158-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.19.046

Abstract In order to establish a simple method for evaluating the resistance of maize hybrids and inbred lines，? the crude toxin extract from the culture medium of Fusarium verticillioides was prepared ， and? the seed germination inhibition rate， radicle growth inhibition rate， as well as the wilting degree of 2 maize hybrids and 4 inbred lines under the treatment of the crude toxin at various dilutions and different treatment duration （4 or 6 d） were determined. The results showed that the susceptible hybrid Yuyu22 and resistant hybrid Nongda108 significantly differed in the inhibition rates of seed germination and radicle growth （P<0.01）， and the inhibition rates of seed germination and radicle growth of Yuyu22 were 7.2%， 11.3% and 12.7%， 11.8% higher than those of Nongda 108. An obvious difference between Yuyu22 and Nongda108 was also found under the treatment of the crude toxin extract at 2 and 5 diluted solution （P<0.05）.

The effects of crude extracts of fusarium rotatum toxin on seed germination and seedling growth of different resistant maize germplasms were obviously different， which provided certain basis for identification and screening of resistance to bacterial blight of maize varieties by using crude extracts of fusarium rotatum toxin.

Key words Maize seedling wilt disease;Fusarium verticillioides;Crude toxin extract;Germination rate;Radicle growth

玉米苗枯病是玉米生產(chǎn)中發(fā)生廣泛、為害嚴(yán)重的病害之一。近年來，由于感病品種推廣、種子帶菌、栽培管理粗放及環(huán)境條件改變等原因，導(dǎo)致該病頻繁發(fā)生，對(duì)玉米生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響[1-3]。引起玉米苗枯病的病菌主要有鐮孢菌、立枯絲核菌、腐霉菌等。其中，擬輪枝鐮孢菌（Fusarium verticillioides）是主要病原菌之一[4-7]。該病菌寄主范圍廣泛，能侵染玉米、小麥等多種糧食作物，常引起苗枯、莖腐、穗腐等癥狀，對(duì)作物生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。該菌有性態(tài)為藤倉赤霉（Gibberella fujikuroi），在為害寄主的過程中，能產(chǎn)生多種非寄主?；舅?，對(duì)人和動(dòng)物有很強(qiáng)的毒性[8]。研究表明，除影響糧食及其產(chǎn)品安全外，該類毒素還與人類癌癥發(fā)生有關(guān)[9-10]。

利用抗病品種是防治該病的有效措施之一[7]。近年來，利用病原菌毒素進(jìn)行抗性材料的篩選逐漸成為品種抗性鑒定的一項(xiàng)重要方法。該方法可以快速、簡便地對(duì)大量材料進(jìn)行初篩，目前已在稻瘟病菌[11-12]、棉花黃萎病菌[13]、小麥赤霉病菌[14]、煙草赤星病菌[15]等病原菌的抗性資源篩選中廣泛應(yīng)用。而針對(duì)擬輪枝鐮孢菌毒素在玉米品種抗性鑒定中的應(yīng)用較少。因此，筆者以引起玉米苗枯病的主要病原菌擬輪枝鐮孢菌為供試病原菌，測定不同濃度的擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對(duì)供試玉米雜交種和自交系的種子發(fā)芽和胚根生長的影響和幼苗的致萎蔫能力，分析毒素粗提液對(duì)玉米種子發(fā)芽和幼苗生長的影響，從而探討利用病菌毒素粗提液篩選抗源材料的可能性，以期為利用毒素快速篩選抗源材料提供依據(jù)，加快抗病育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 玉米種子。

玉米雜交種：農(nóng)大108，對(duì)玉米苗枯病表現(xiàn)抗病;豫玉22，對(duì)玉米苗枯病表現(xiàn)為感病。

玉米自交系：5008-1、熊掌S以及BT，對(duì)玉米苗枯病表現(xiàn)抗病;N6，對(duì)玉米苗枯病表現(xiàn)感病。

供試玉米材料分別由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、鄭州國家玉米改良分中心提供。

1.1.2 供試菌種。

從河南省玉米苗枯病的發(fā)病田間采集病樣，經(jīng)組織分離、純化后，按柯赫氏法則進(jìn)行鑒定，確定為擬輪枝鐮孢菌，在4 ℃冰箱保存。

1.1.3 培養(yǎng)基。

Richard 培養(yǎng)基：硝酸鉀（KNO3）10.0 g，硫酸鎂（MgSO47H2O）2.5 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）5.0 g，氯化鐵（FeCl3）0.02 g，蔗糖50.0 g，蒸餾水1 000 mL。配制后分裝，121 ℃下高壓滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液制備。

將保存在4 ℃冰箱的擬輪枝鐮孢菌轉(zhuǎn)置PDA培養(yǎng)基平板上，25 ℃條件下培養(yǎng)7 d。在無菌條件下，用直徑7 mm打孔器將長滿病原菌的PDA培養(yǎng)基切成菌塊，再轉(zhuǎn)置于裝有Richard培養(yǎng)液的三角瓶中，每瓶分裝5個(gè)菌塊。將三角瓶放在振蕩培養(yǎng)箱（22 ℃，1 400 r/min）培養(yǎng)20 d，而后用12層紗布過濾。將濾出液在6 000 r/min下離心20 min，收集上清液，在121 ℃下滅菌20 min，冷卻后備用。

1.2.2 擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對(duì)玉米種子發(fā)芽和胚根生長的影響。

先將玉米種子用無菌水浸泡24 h，撈出濾干水分，加入75 %乙醇表面消毒5 min。然后用無菌水將消毒過的種子沖洗3次，擺放在鋪有滅菌濾紙的250 mL三角瓶中，每三角瓶擺放20粒，加入50 mL稀釋倍數(shù)分別為0、1、2、5倍的毒素粗提液，以無菌水為對(duì)照，用無菌濾膜覆蓋瓶口，重復(fù)3次。將處理好的三角瓶放置于25 ℃、光暗比為12 h：12 h的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)4和6 d時(shí)調(diào)查，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、胚根長度，按下列公式計(jì)算毒素粗提液對(duì)種子發(fā)芽的抑制率和對(duì)胚根生長的抑制率。

種子發(fā)芽抑制率=（對(duì)照種子發(fā)芽率-處理種子發(fā)芽率）/對(duì)照種子發(fā)芽率×100%

胚根生長抑制率=（對(duì)照胚根長度-處理胚根長度）/對(duì)照胚根長度×100%

1.2.3 擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對(duì)玉米幼苗的致萎蔫作用。

玉米種子經(jīng)75 %乙醇表面消毒5 min、無菌水沖洗3次后，播于裝有無菌沙土（沙∶土=3∶1）的營養(yǎng)缽中，待玉米苗2葉期時(shí)，小心拔出幼苗，沖洗干凈后，將切除根系的幼苗分別浸入裝有不同稀釋倍數(shù)的擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液的燒杯中，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)20株，無菌水處理為對(duì)照。處理后24、48、72、96 h時(shí)觀察記錄玉米幼苗失水萎蔫程度[16]。

玉米幼苗萎焉程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：“-”，所有幼苗的葉片無萎蔫癥狀;“+”，一級(jí)萎蔫，供試材料中，葉片輕度失水萎蔫的幼苗占50%以上;“++”，二級(jí)萎蔫，供試材料中，整株葉片失水萎蔫的幼苗占50%以上;“+++”，三級(jí)萎蔫，供試材料中，整株葉片失水干枯的幼苗占50%以上。

1.3 數(shù)據(jù)分析 利用Excel計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差，利用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，多重比較用鄧肯氏法。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對(duì)玉米種子發(fā)芽的影響

由圖1可知，毒素粗提液對(duì)玉米種子發(fā)芽的抑制作用與濃度、處理時(shí)間和玉米品種抗性有一定關(guān)系。處理4和6 d后，不同稀釋倍數(shù)毒素粗提液對(duì)種子發(fā)芽抑制率的變化趨勢基本相似（圖1），不同稀釋倍數(shù)的毒素粗提液對(duì)不同抗、感性的玉米雜交種和自交系種子的發(fā)芽抑制率均達(dá)顯著水平（P<0.05），不同稀釋倍數(shù)的毒素粗體液對(duì)玉米苗枯病表現(xiàn)感病的自交系品種N6的種子發(fā)芽抑制率達(dá)極顯著水平（P<0.01），除毒素粗提液處理后6 d的感病雜交種豫玉22（P>005）外，毒素粗提液的稀釋倍數(shù)與其他玉米品種處理后4和6 d的種子發(fā)芽抑制率均呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05）（表1）。

由圖1可知，擬輪枝鐮孢菌毒素粗提原液對(duì)種子發(fā)芽的抑制率最高，其中，在毒素粗提液處理4 d時(shí)，抗病雜交種農(nóng)大108的種子發(fā)芽抑制率為86.0 %，抗病自交系品種的種子發(fā)芽抑制率為61.0%～84.6%;對(duì)感病雜交種豫玉22 的種子發(fā)芽抑制率為92.6%，對(duì)感病自交系N6的種子發(fā)芽抑制率達(dá)94.2%;隨處理后天數(shù)增加，在毒素粗提液處理后6 d時(shí)，感病雜交種和自交系品種的種子發(fā)芽抑制率分別達(dá)934%和95.3%;由圖1可知，擬輪枝鐮孢菌的毒素粗提液原液對(duì)同是抗病雜交種和自交系及同是感病的雜交種和自交系的種子發(fā)芽抑制效果基本一致。隨稀釋倍數(shù)增加，毒素粗提液對(duì)種子發(fā)芽的抑制率呈逐漸降低趨勢，當(dāng)稀釋5倍時(shí)，處理4 d后的抗病雜交種農(nóng)大108和抗病自交系5008-1的種子發(fā)芽平均抑制率分別為4.9%和-2.0%，感病雜交種豫玉22和感病自交系N6的種子發(fā)芽平均抑制率分別為8.1%和429%;處理6 d后的抗病雜交種農(nóng)大108和抗病自交系5008-1的種子發(fā)芽平均抑制率分別為11.4%和1.3%，感病雜交種豫玉22和感病自交系N6的種子發(fā)芽平均抑制率分別為338%和44.7%。同一濃度毒素粗提液對(duì)玉米抗、感品種的種子發(fā)芽抑制率不同，毒素粗提液對(duì)感病雜交種和自交系玉米種子發(fā)芽的抑制率高于抗病雜交種和自交系的玉米品種（圖1）。

2.2 擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對(duì)玉米種子胚根生長的影響

由圖2可知，擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對(duì)玉米雜交種胚根生長的抑制作用與毒素濃度、處理后時(shí)間和試驗(yàn)材料的差異有關(guān)，隨著病原菌毒素粗提液稀釋倍數(shù)的增加，對(duì)供試玉米種的胚根生長抑制作用減小。毒素粗體液處理后4和6 d時(shí)，各稀釋倍數(shù)的毒素粗提液對(duì)胚根生長的抑制效果變化趨勢基本相同。擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液稀釋倍數(shù)與玉米種子胚根生長抑制率呈負(fù)相關(guān)，但除感病雜交種豫玉22外，其余供試玉米雜交種和自交系的種子胚根生長抑制率與擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液稀釋倍數(shù)間的負(fù)相關(guān)性未達(dá)顯著水平（P>0.05），這與對(duì)種子發(fā)芽抑制的表現(xiàn)不同（表2）。由圖2、表2還可以看出，擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對(duì)玉米雜交種和自交系胚根的生長抑制作用不同，對(duì)雜交種胚根生長的抑制作用略強(qiáng)于自交系。擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液原液處理4和6 d后，抗病雜交種農(nóng)大108胚根生長抑制率分別為931%和95.8%，而感病雜交種豫玉22的胚根生長抑制率高達(dá)100%。

2.3 擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對(duì)玉米雜交種幼苗的致萎蔫作用

由表3可知，當(dāng)擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液濃度較高（稀釋倍數(shù)為0和1）時(shí)，抗、感雜交種幼苗間的萎蔫程度變化基本一致，均隨處理時(shí)間延長而加重。在處理后96 h時(shí)，抗、感雜交種均表現(xiàn)3級(jí)萎蔫。當(dāng)毒素粗提液濃度較低（稀釋倍數(shù)≥2）時(shí)，抗、感雜交種幼苗間的萎蔫程度變化出現(xiàn)明顯差異。在2倍稀釋時(shí)，抗病雜交種農(nóng)大108 在處理后48 h時(shí)才開始出現(xiàn)萎蔫;在處理后96 h時(shí)，萎蔫程度僅達(dá)2級(jí)。相對(duì)地，感病雜交種豫玉22在處理后24 h時(shí)即出現(xiàn)萎蔫，在處理后72 h達(dá)2級(jí)萎蔫。在5倍稀釋倍數(shù)時(shí)，抗病雜交種在處理后72 h時(shí)才開始出現(xiàn)萎蔫，到96 h時(shí)，萎蔫程度仍為一級(jí);感病雜交種豫玉22在處理后48 h即出現(xiàn)萎蔫，在處理后96 h時(shí)達(dá)到二級(jí)萎蔫。因此，利用致萎蔫作用試驗(yàn)評(píng)價(jià)玉米雜交種抗性時(shí)，稀釋倍數(shù)以2～5倍為宜。

3 結(jié)論與討論

鐮孢菌毒素主要有單端孢霉烯類、玉蜀黍赤霉烯類和伏馬毒素3類[17-19]，擬輪枝鐮孢菌侵染寄主后可產(chǎn)生多種毒素，如伏馬毒素、萎蔫酸、鐮孢菌酸等，該類毒素可對(duì)動(dòng)、植物的正常生長造成傷害[20]。植物受到病原真菌侵染后，病原菌產(chǎn)生的多種毒素可以作用于細(xì)胞質(zhì)膜，影響細(xì)胞膜的透性改變;也可以直接作用于細(xì)胞核和核糖體，影響細(xì)胞分裂。擬輪枝鐮孢菌產(chǎn)生的多種毒素，既可以影響細(xì)胞膜的透性，也可以影響寄主細(xì)胞的分裂，植物受害后通常表現(xiàn)萎蔫，或生長受到影響[21]。

該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對(duì)玉米種子的發(fā)芽和胚根生長具有較明顯的抑制作用，對(duì)供試玉米雜交種的幼苗也有明顯的致萎蔫作用。擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液的作用效果與多種因素有關(guān)。首先，擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液的濃度對(duì)各項(xiàng)測定指標(biāo)有較大影響。該研究發(fā)現(xiàn)，隨稀釋倍數(shù)的增加，毒素粗提液對(duì)玉米種子的發(fā)芽、胚根的生長、幼苗萎蔫程度等的影響作用減小，這與田雪亮等[6]的研究結(jié)果一致。無論是玉米雜交種還是自交系的種子發(fā)芽和胚根生長試驗(yàn)中都可以觀察到，隨稀釋倍數(shù)的增加，抗病和感病雜交種材料間的抑制率差值有擴(kuò)大趨勢。在玉米雜交種幼苗致萎蔫試驗(yàn)中，在0～1倍稀釋時(shí)，幼苗的萎蔫程度無差異;只有稀釋倍數(shù)為2～5倍時(shí)，幼苗的萎蔫程度才會(huì)出現(xiàn)差異。綜合該研究結(jié)果，在今后進(jìn)行玉米抗性鑒定試驗(yàn)時(shí)，可考慮選用的比較適宜的擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液稀釋倍數(shù)為2倍或5倍。其次，毒素作用時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果也有較大影響。在玉米雜交種試驗(yàn)中，4 d處理已經(jīng)能很明確地區(qū)分不同抗性的種質(zhì)，但6 d處理的種子發(fā)芽和胚根生長抑制率均顯著高于4 d處理的對(duì)應(yīng)值（P<0.01），因此今后鑒定試驗(yàn)中，應(yīng)處理時(shí)間稍長。第三，玉米種質(zhì)的抗性與種子發(fā)芽和胚根生長抑制率、幼苗致萎蔫效果等也存在一定關(guān)系?？傮w來看，在玉米雜交種種子發(fā)芽和胚根生長抑制試驗(yàn)中，毒素對(duì)抗性雜交種農(nóng)大108種子發(fā)芽和胚根生長的抑制率在處理后4、6 d時(shí)比易感雜交種豫玉22的對(duì)應(yīng)值分別低7.2%、11.3%、12.7%、11.8%，說明這2項(xiàng)試驗(yàn)?zāi)芎芎玫貐^(qū)別抗性和易感玉米雜交種;農(nóng)大108適宜作為種子發(fā)芽和胚根生長抑制試驗(yàn)中的抗性雜交種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，而豫玉22也適合作為易感雜交種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，應(yīng)用于雜交種玉米抗性的初步鑒定。在玉米自交系種子發(fā)芽抑制試驗(yàn)中，毒素對(duì)易感自交系N6的指標(biāo)均比對(duì)抗性自交系BT、熊掌S和5008-1的對(duì)應(yīng)值分別高218%～262%、96.8%，且抗性自交系之間也存在一定差異，說明通過病原菌毒素粗提液對(duì)種子發(fā)芽抑制的測定試驗(yàn)，可大致區(qū)分部分感病和抗病自交系。但在胚根生長抑制試驗(yàn)中，感病自交系N6的均值分別明顯高于抗性自交系熊掌S和5008-1的對(duì)應(yīng)值，但與自交系BT的胚根生長抑制率無顯著差異。今后應(yīng)收集較大量的自交系材料，運(yùn)用毒素粗提液進(jìn)行鑒定，才能對(duì)鑒定材料的抗性結(jié)果作出較為客觀的評(píng)價(jià)。

綜上所述，今后在對(duì)較大量玉米種質(zhì)資源進(jìn)行玉米苗枯病抗性鑒定和篩選時(shí)，可以考慮結(jié)合利用擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液來進(jìn)行鑒定，經(jīng)對(duì)大量鑒定材料、多次鑒定結(jié)果比對(duì)后，如與利用病原菌鑒定差異不顯著，可考慮用此方法部分代替玉米苗枯病菌進(jìn)行品種抗性鑒定和篩選。此方法簡便易行，可在室內(nèi)較短時(shí)間對(duì)大量待鑒定材料進(jìn)行鑒定，有效提高抗性鑒定的效率[22-24]。

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