擬南芥IbbHLH家族基因CRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建

樊玲玲 馬銘悅 韓毅

摘要 [目的]全氟辛酸（PFOA）處理能顯著誘導(dǎo)擬南芥Ib bHLH（Ib basic helixloophelix）家族4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子bHLH38、bHLH39、bHLH100和bHLH101的轉(zhuǎn)錄水平。為了進(jìn)一步分析這4個(gè)基因在響應(yīng)PFOA中的潛在作用，利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了它們的共敲除載體。[方法]以野生型擬南芥基因中的外顯子為模板，設(shè)計(jì)引物，通過兩步PCR擴(kuò)增法將靶向基因連接到CRISPR/Cas9載體上;將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性菌落，PCR鑒定正確后，將其質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，再次挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR鑒定正確后，提取質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)盒測(cè)序。[結(jié)果]通過兩步PCR擴(kuò)增法，成功將4個(gè)靶點(diǎn)表達(dá)盒轉(zhuǎn)入到CRISPR/Cas9載體中，構(gòu)建了bHLH38、bHLH39、bHLH100和bHLH101的雙元CRISPR/Cas9敲除載體。[結(jié)論]成功構(gòu)建的Ib BHLH家族CRISPR/Cas9敲除載體，為后續(xù)擬南芥Ib BHLH家族四突突變體材料的獲得提供了可用性載體。

關(guān)鍵詞 擬南芥;Ib BHLH家族基因;載體構(gòu)建;CRISPR/Cas9

中圖分類號(hào) Q945.78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）19-0118-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.19.035

Abstract [Objective]Perfluorooctanoic acid （PFOA） treatment significantly induced the transcription levels of the Ib bHLH（Ib basic helixloophelix） family four transcription factors bHLH38， bHLH39， bHLH100 and bHLH101 of Arabidopsis thaliana. To further analyze the potential role of these four genes in response to PFOA， we used the CRISPR/Cas9 technology to construct their coknockout vector. [Method]Primers were designed using exons in the wildtype Arabidopsis thaliana genes as a template， and the target genes were ligated to the CRISPR/Cas9 vector by twostep PCR amplification. The successfully constructed recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli DH5α， positive colonies were picked. After PCR identification， the plasmid was extracted and transferred into Agrobacterium GV3101 receptive cells， positive colonies were picked again for PCR identification. The plasmid was extracted and sequenced. [Result]Four target expression cassettes were successfully transferred into the CRISPR/Cas9 vector by twostep PCR amplification， and a binary CRISPR/Cas9 knockout vector of bHLH38， bHLH39， bHLH100 and bHLH101 was constructed. [Conclusion]The successfully constructed Ib BHLH family CRISPR/Cas9 knockout vector provides an availability vector for the subsequent Arabidopsis thaliana Ib BHLH family of tetramer mutant materials.

全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）是一種人工合成化合物，被廣泛應(yīng)用于如油漆、紡織品和化妝品在內(nèi)的各種工商業(yè)產(chǎn)品中。PFOA的持續(xù)使用和大量排放使其越來越多地分布于環(huán)境中。目前，幾乎在所有環(huán)境和生物基質(zhì)中都能檢測(cè)到其存在[1]。環(huán)境中存在的PFOA可以經(jīng)過水體和土壤進(jìn)入植物，在植物體內(nèi)進(jìn)行富集。目前，已經(jīng)在小麥、土豆、胡蘿卜等多種作物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了PFOA的積累[2-3]。植物體內(nèi)高濃度的PFOA會(huì)造成嚴(yán)重的生長(zhǎng)和發(fā)育毒害[3-5]，但其毒性作用機(jī)制目前尚不清楚。采用模式植物擬南芥對(duì)PFOA造成的毒性作用機(jī)制進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PFOA會(huì)強(qiáng)烈誘導(dǎo)擬南芥bHLH Ib亞族所有4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子bHLH38、bHLH39[6]、bHLH100和bHLH101[7]的表達(dá)。

Ib亞族的4個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子在鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，在缺鐵條件下，至少有1個(gè)與FIT形成二聚體，才能激活鐵吸收相關(guān)蛋白FRO2和IRT1的表達(dá)，促進(jìn)植物根部對(duì)鐵的吸收[8]。在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，以上4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中任何一個(gè)基因的突變都不會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)造成影響，但是bHLH38與bHLH100/bHLH101及bHLH39與bHLH100/bHLH101的雙基因或三基因突變，會(huì)使擬南芥出現(xiàn)小化和黃化的癥狀[9]。擬南芥bHLH38和bHLH39由于連鎖，所以無法通過傳統(tǒng)雜交手段獲得四突突變體。

[7] SIVITZ A B，HERMAND V，CURIE C，et al.Arabidopsis bHLH100 and bHLH101 control iron homeostasis via a FITindependent pathway[J].PLoS One，2012，7（9）：1-12.

[8] WANG H Y，KLATTE M，JAKOBY M，et al.Iron deficiencymediated stress regulation of four subgroup Ib BHLH genes in Arabidopsis thaliana[J].Planta，2007，226（4）：897-908.

[9] WANG N，CUI Y，LIU Y，et al.Requirement and functional redundancy of Ib subgroup bHLH proteins for iron deficiency responses and uptake in Arabidopsis thaliana[J].Mol Plant，2013，6（2）：503-513.

[10] MA X L，ZHANG Q Y，ZHU Q L，et al.A robust CRISPR/Cas9 system for convenient，highefficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants[J].Molecular plant，2015，8（8）：1274-1284.

[11] LIU W S，ZHU X H，LEI M G，et al.A detailed procedure for CRISPR/Cas9mediated gene editing in Arabidopsis thaliana[J].Science bulletin，2015，60：1332-1347.

[12] 曾棟昌，馬興亮，謝先榮，等.植物CRISPR/Cas9多基因編輯載體構(gòu)建和突變分析的操作方法[J].中國(guó)科學(xué)，2018，48（7）：783-794.

[13] LINDSTROM A B，STRYNAR M J，LIBELO E L.Polyfluorinated compounds：Past，present，and future[J].Environ Sci Technol，2011，45（19）：7954-7961.